真菌漆酶高產(chǎn)菌株的篩選、發(fā)酵及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、漆酶(EC1.10.3.2，對(duì)苯二酚∶氧氧化還原酶)是一種含多個(gè)銅原子的多酚氧化酶，催化氧化多種芳香族化合物，在木質(zhì)素礦化降解、腐殖質(zhì)形成等過程中發(fā)揮重要作用。在環(huán)境修復(fù)、生物漂白與制漿、綠色有機(jī)合成、食品加工和生物傳感器等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。 本文以探索漆酶的高效生產(chǎn)為宗旨，對(duì)漆酶高效產(chǎn)生菌株的篩選、發(fā)酵產(chǎn)酶、漆酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)等方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究和分析，獲得了國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的最新成果，結(jié)果如下： 1.

2、以愈創(chuàng)木酚和a-萘酚均被氧化顯色作為檢測(cè)方法，對(duì)14份土壤樣品中的產(chǎn)漆酶菌株進(jìn)行了篩選，分析比較了另外38株不同類別菌株的產(chǎn)漆酶能力，并且對(duì)3株高產(chǎn)菌株的漆酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較研究。發(fā)現(xiàn)菌株WZFF.W-Y11搖瓶發(fā)酵8d的漆酶活力(底物：愈創(chuàng)木酚)達(dá)到1165U/mL，漆酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，60℃時(shí)酶活的半衰期大于60min；最適反應(yīng)pH為3.5-4.5，在pH3.5-9.0酶活保存率大于90％；是一株產(chǎn)酶活力高、發(fā)酵時(shí)間短、酶

3、學(xué)性質(zhì)優(yōu)的漆酶高效產(chǎn)生菌；經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，該菌為煙管菌(黑管菌)Bjerkanderaadusta(Willd.exFr.)Karst.。 2.通過正交實(shí)驗(yàn)、均勻設(shè)計(jì)研究了煙管菌WZFF.W-Y11產(chǎn)漆酶的發(fā)酵條件。結(jié)果表明，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)基組成是：淀粉24g、葡萄糖24g、豆餅粉4.8g、NH4Cl3.2g、KH2PO43.2g、MgSO4·7H2O0.2g、CuSO4·5H2O0.006g、麩皮水解液1％、水1000

4、mL、pH6.5。在28℃、150r/m、50mL/250mL的搖瓶培養(yǎng)條件下發(fā)酵5d，產(chǎn)酶活力達(dá)到了9672±954U/mL(底物：愈創(chuàng)木酚)。 3.煙管菌WZFF.W-Y11的粗酶液經(jīng)過丙酮分級(jí)沉淀、DEAE-Cellulose離子交換層析、SephadexG-100凝膠過濾，得到了三種電泳純的漆酶同工酶，總酶活回收率達(dá)到65.5％，其中LacA達(dá)到48.2％；平均純化了18.7倍，LacC純化了18.5倍、LacA純化了2

5、9.2倍；三種同工酶的分子量分別為L(zhǎng)acA：68.7KD、LacB：80.2KD、LacC：77.2KD。 4.研究測(cè)定了LacA、LacC的酶學(xué)性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)LacA、LacC氧化愈創(chuàng)木酚的Km大于氧化ABTS的Km，最適反應(yīng)溫度在45℃-70℃，最適反應(yīng)pH3-5.5，65℃時(shí)LacC比LacA穩(wěn)定，LacC在pH4-6穩(wěn)定，LacA在pH7-8穩(wěn)定，Al3+對(duì)LacC、LacA的酶活有促進(jìn)作用，Cl-、Fe3+、Hg2+抑制L