A20抑制TNF-α誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的遷移.pdf

1、目的:
　　通過一系列實(shí)驗(yàn)我們初步證明A20可抑制TNFa增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力，并且是通過影響EMT和FAK來實(shí)現(xiàn)的。
　　方法:
　　一、采用肝癌臨床標(biāo)本檢測A20的表達(dá)與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　二、選擇確定及培養(yǎng)A20高表達(dá)細(xì)胞株和低表達(dá)細(xì)胞株
　　三、A20對肝癌細(xì)胞系運(yùn)動能力的作用及其機(jī)制研究
　　四、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證A20對肝癌細(xì)胞運(yùn)動性的作用
　　結(jié)果:
　　一、A20與肝癌的

2、轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性
　　在肝癌病人組織芯片中，75例病人的肝癌組織和癌旁組織檢測A20的表達(dá)差異，選擇相應(yīng)視野通過統(tǒng)計(jì)分析得出A20在癌旁組織中的表達(dá)顯著高于其在肝癌組織中的表達(dá)(P＜0.001)。
　　我們探究A20能否抑制肝癌的轉(zhuǎn)移，選用106例肝癌病人組織切片進(jìn)行免疫組化雙染，目的蛋白為A20和血管內(nèi)皮CD34，其中A20被染成棕色，CD34被染成紅色。其中有89例肝癌病人組織切片可以觀察到腫瘤細(xì)胞的微血管侵犯。統(tǒng)計(jì)分析可

3、以得出進(jìn)入到血管中的腫瘤細(xì)胞其A20的表達(dá)顯著低于未侵入血管中的腫瘤細(xì)胞A20的表達(dá)(P＜0.001)。這提示A20可能對肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起到抑制作用。
　　為了進(jìn)一步確定侵入血管中的是腫瘤細(xì)胞而不是其他間質(zhì)細(xì)胞，我們采用組化雙染，靶蛋白為CD34和角蛋白CK8/18，其中CK8/18蛋白染成棕色，CD34被染成紅色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)侵入血管中的細(xì)胞可表達(dá)角蛋白CK8/18，這表明侵入血管中的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
　　二、肝癌細(xì)胞系中A2

4、0表達(dá)差異的鑒定
　　我們選用五種肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、Hep-3B、HCCLM3通過蛋白水平檢測Hep-3B為A20高表達(dá)細(xì)胞株，SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、HCCLM3為A20低表達(dá)細(xì)胞株。因此在體外實(shí)驗(yàn)過程中我們選用SMMC-7721、huh-7構(gòu)建A20過表達(dá)體系，選用Hep-3B進(jìn)行A20干擾使其低表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時選用肝癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HCCLM3構(gòu)建腫瘤模

5、型。
　　三、A20能夠抑制TNFα誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移
　　體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證A20對肝癌侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)的研究采用細(xì)胞跨膜的方法即transwell小室來實(shí)施:結(jié)果顯示在TNFa刺激下，當(dāng)高表達(dá)A20時，A20能夠抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力:當(dāng)干擾A20表達(dá)后，干擾組的肝癌細(xì)胞其遷移和侵襲能力則會增強(qiáng)。然而，在未刺激組無論A20表達(dá)高低與否，其對肝癌細(xì)胞的運(yùn)動能力沒有作用。因此我們認(rèn)為A20可抑制由TNFa誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞

6、的運(yùn)動能力。
　　四、A20主要通過影響EMT進(jìn)程和FAK的活化來抑制肝癌細(xì)胞的運(yùn)動能力
　　對其機(jī)制研究發(fā)現(xiàn):首先A20是典型的NF-κB抑制劑，它能抑制TNFa引起的NF-κ B的活化。隨后通過查閱文獻(xiàn)我們猜想:A20可能通過影響肝癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程和FAK-RAC1通路來抑制TNFα誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。我們選取A20過表達(dá)和低表達(dá)兩種細(xì)胞體系來驗(yàn)證猜想。首先，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A20能抑制TNFa誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的EMT進(jìn)

7、程，即在蛋白水平和RNA水平均能上調(diào)E-cad，下調(diào)N-cad。隨后，我們阻斷NF-κ B通路，發(fā)現(xiàn)A20抑制EMT相關(guān)分子的現(xiàn)象消失了。說明A20通過阻斷NF-κ B通路來抑制TNFa誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT進(jìn)程。其次，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A20可以降低TNFa誘導(dǎo)的FAK的磷酸化水平，同時降低了FAK下游的RAC1-GTP活性。我們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)沉默RIPK1表達(dá)后A20對TNFa誘導(dǎo)的FAK活化的抑制作用明顯減弱了，這表明A20可能通過對RIPK1的泛

8、素化降解，影響RIPK1和FAK的結(jié)合，進(jìn)而抑制FAK的活化。而在未刺激組中無論A20表達(dá)高低與否，其對EMT分子和FAK、RAC1的表達(dá)均無明顯作用。綜上所述，我們認(rèn)為A20可通過抑制TNFa引起的NF-κ B的活化來阻礙肝癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程，還可以通過RIPK1來阻斷FAK-RAC1通路的活化，從而最終抑制TNFa誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的運(yùn)動能力。
　　五、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證A20對肝癌運(yùn)動能力的作用
　　在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證明A20可

9、以通過作用于EMT和FAK抑制TNFa誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的運(yùn)動能力，因此我們通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證A20的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組（注射空白載體pRK5）相比，實(shí)驗(yàn)組（注射pRK5-A20質(zhì)粒）腫瘤細(xì)胞微血管侵犯的數(shù)量顯著減少。這表明A20對肝癌運(yùn)動能力的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　一、A20抑制由TNFa誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的運(yùn)動能力。
　　二、A20通過影響EMT進(jìn)程來抑制TNFa誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的運(yùn)動能力。