微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛及其衍生物制備天然香料和手性化合物的研究.pdf

1、我國有豐富的肉桂油資源,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。肉桂油的主要成分是肉桂醛和肉桂酸。本文以肉桂醛及肉桂酸為起始底物,開展了基于“C=C”鍵和“C=O”鍵的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)研究,制備了一系列的天然香料和手性1-苯乙醇。主要研究內(nèi)容和取得的成果如下:
　　 1.采用含富集培養(yǎng)的方式對土壤中進(jìn)行了大量的能耐受肉桂醛菌株的篩選,得到了16株能將肉桂醛轉(zhuǎn)化為苯甲醛的菌株(苯甲醛含量＞5％),其中菌株JX-93的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng);得到了10株能

2、將肉桂醛轉(zhuǎn)化為肉桂醇的菌株(肉桂醇含量＞20％),其中菌株JX-23的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng);經(jīng)形態(tài)鑒定及ITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,鑒定為毛霉(Mucorsp.),命名為Mucorsp.JX-23。對JX-23代謝的酶系進(jìn)行初步研究,JX-23產(chǎn)生的氧化還原酶是誘導(dǎo)型的胞內(nèi)酶,當(dāng)分別添加肉桂醛、肉桂酸、苯乙酮為催化底物時,JX-23能分別將底物高選擇性地轉(zhuǎn)化為肉桂醇、苯乙酮、1-苯乙醇。
　　 采用富集培養(yǎng)的方式對土壤中進(jìn)行了大

3、量的能耐受肉桂酸菌株的篩選,得到了一株能將肉桂酸高效、高選擇性轉(zhuǎn)化為苯乙酮的菌株JX-66。將該菌株的16SrRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,JX-66鑒定為伯克氏菌(Burkholderiasp.),命名為Burkholderiasp.JX-66。
　　 用含苯乙酮的富集培養(yǎng)基從土壤中篩選到菌株IS118可以將苯乙酮不對稱還原為(R)-1-苯乙醇。將該菌株的18rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,IS118鑒定為溜曲霉(

4、Asperillustamarii),命名為AsperillustamariiIS118。
　　 用含1-苯乙醇的富集培養(yǎng)基從土壤中篩選到菌株S307可選擇性的氧化消旋1-PEA中的(S)-1-PEA為苯乙酮,實現(xiàn)(D,L)-1-苯乙醇的氧化拆分。經(jīng)16SrRNA基因序列比對,該菌株確定為草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)Undibacterium屬的一個種,命名為Undibacteriumsp.S307。
　

5、　 2.進(jìn)行JX-93轉(zhuǎn)化肉桂醛為苯甲醛的研究,開拓了制備天然苯甲醛新方法。
　　 對菌株JX-93進(jìn)行濃度梯度馴化培養(yǎng),得到馴化菌株JX-93ⅡB。以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、在pH為6.0,30℃的條件下培養(yǎng)JX-93ⅡB48h后,加入肉桂醛2g/L,30℃,有氧條件下轉(zhuǎn)化3天,產(chǎn)物中苯甲醛的含量提高到20％以上。
　　 3.利用Mucorsp.JX-23催化肉桂醛高選擇性生物還原加氫制備肉桂醇,實現(xiàn)了溫和條件下

6、“C=C”選擇加氫的新方法。
　　 以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、在pH為6.0,30℃的條件下培養(yǎng)Mucorsp.JX-2348h后,加入0.5g·L-1吐溫-80,然后按分3次添加肉桂醛至總濃度為4.0g/L,pH=6.0,30℃,180rpm條件下轉(zhuǎn)化72h,肉桂醛的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高83.1％,生成肉桂醇的選擇性為88.0％。轉(zhuǎn)化液中肉桂醇的總濃度達(dá)到2.9g/L。
　　 4.肉桂酸生物降解合成苯乙酮的工藝條件優(yōu)化,

7、為具有實用價值的、高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高選擇性的合成提供實驗基礎(chǔ)。
　　 Mucorsp.JX-23在以葡萄糖為碳源,蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)48h后,將溶解在乙醇中的肉桂酸分三次添加到發(fā)酵液中,使其總濃度為6.0g/L,在pH=6.0,30℃,180rpm的條件下轉(zhuǎn)化48h,肉桂酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到81％,轉(zhuǎn)化液中苯乙酮的含量達(dá)到3.8g/L。
　　 Burkholderiasp.JX-66在以蔗糖為碳源,牛肉膏為氮源

8、的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)48h后,將溶解在乙醇中的肉桂酸分三次添加到發(fā)酵液中,使其總濃度為6.0g/L,在pH=9.0,30℃,180rpm的條件下轉(zhuǎn)化48h,肉桂酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到74％,轉(zhuǎn)化液中苯乙酮的含量達(dá)到3.3g/L。
　　 5.微生物催化苯乙酮不對稱還原合成手性苯乙醇,為手性苯乙醇的合成提供一種新途徑。
　　 Mucorsp.JX23催化苯乙酮不對稱還原為(S)-1-苯乙醇。在底物濃度為3.0g/L,體系pH為7.0

9、的條件下,30℃反應(yīng)54h,(S)-1-苯乙醇的濃度達(dá)到2.3g/L,產(chǎn)率為77％,e.e.值為89％。
　　 AsperillustamariiIS118催化苯乙酮不對稱還原為(R)-1-苯乙醇。在底物濃度為2.0g/L,體系pH為7.0的條件下反應(yīng)3天,(R)-1-苯乙醇的濃度達(dá)到1.4g/L,e.e.值為91％。
　　 6.建立了Undibacteriumsp.S307催化氧化拆分與Asperillustamari

10、iIS118催化不對稱還原耦聯(lián),進(jìn)行消旋1-PEA去消旋化制備高純度的(R)-1-苯乙醇的新方法。
　　 順序使用兩種微生物發(fā)酵液同底物反應(yīng):Undibacteriumsp.S307發(fā)酵培養(yǎng)48h后,添加消旋1-苯乙醇,使其濃度為4.0g/L。自然pH,30℃,180rpm,搖瓶轉(zhuǎn)化48h,得到的氧化拆分產(chǎn)物直接加入AsperillustamariiIS118發(fā)酵液,轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化92h。反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)體系中(R)-1-PEA含量＞