畢赤酵母GS115菌株FLD1啟動子的克隆與功能分析.pdf

1、畢赤酵母FLD1基因編碼甲醛脫氫酶，它是在甲醇作為碳源和能源、甲胺為氮源時進行代謝過程中主要的酶，畢赤酵母中FLD1啟動子能單獨被甲醇為單一碳源(硫酸胺為氮源)或甲胺為單一氮源(葡萄糖為碳源)強烈誘導，有葡萄糖的時候甲醇也能夠誘導PFLD1，用甲醇和甲胺一起誘導PFLD1，能達到最高表達水平.用甲胺作為氮源以及山梨糖醇為碳源的誘導就逐漸形成了無甲醇培養(yǎng)基基質(zhì)，并解決了與PAOX1相關(guān)聯(lián)的問題。
　　 FLD1啟動子的啟動表達是在

2、轉(zhuǎn)錄水平控制的，并且能達到與PAOX1相當水平的轉(zhuǎn)錄效率和強調(diào)節(jié)。這些性能使得PFLD1成為一種受人關(guān)注的可選擇啟動子，以用于畢赤酵母中外源基因的表達。
　　 根據(jù)在EMBL的登錄號AR533312保存的FLD1啟動子序列，我們合成了兩條引物，并且以畢赤酵母GS115基因組DNA為模板，由PCR擴增出了FLD1啟動子的序列。
　　 測序分析表明，擴增的序列分別在-30和-445位置有單堿基突變。通過誘發(fā)分子突變的方法使突

3、變序列變回到野生型。
　　 用綠色熒光蛋白基因作為報告基因，我們各自在雙表達盒的載體上評價突變型和野生型FLD1啟動子序列的功能，一個表達盒處于PAOX1下面，另一個則是GFP表達盒，在我們的FLD1啟動子控制下。
　　 通過把帶有克隆體的酵母菌株培養(yǎng)到7個試驗培養(yǎng)基中來進行試驗，對兩個PFLD1功能以及它們在雙表達盒載體上的能力做了對比。
　　 這7個實驗培養(yǎng)基分別包含以下的碳源和氮源：(1)葡萄糖和銨鹽(G/