利用19F位點特異性標記和19F核磁共振方法的原位蛋白質(zhì)相互作用和功能分析.pdf

1、此論文中主要討論了非天然氨基酸標記的方法和應(yīng)用，19F NMR的優(yōu)勢和在各領(lǐng)域中的應(yīng)用。我們結(jié)合非天然氨基酸標記和19F NMR來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，本論文共分為六個章節(jié)。
　　第一章介紹了非天然氨基酸標記的方法及其應(yīng)用。通過非天然氨基酸的引入來研究生物學(xué)過程，可以解決傳統(tǒng)方法無法解決的一些問題。將非天然氨基酸位點特異性引入最有力的方法是通過遺傳密碼子擴增，該方法在需要標記的位置引入琥珀密碼子(TAG)突變，篩選到能識別琥珀密

2、碼子的氨酰tRNA合成酶/tRNA對將非天然氨基酸引入，另外，可以通過化學(xué)連接方法輔助這種非天然氨基酸引入的方法。非天然氨基酸也可以通過選擇壓力的方法以氨基酸特異性的方式引入，這種方法會導(dǎo)致基因組特定氨基酸全方面的標記，而不是定點標記。本章還重點介紹了氨基酸特異性和位點特異性兩種非天然氨基酸標記方法在各方面的應(yīng)用以及在一些前沿科技方面的應(yīng)用。
　　第二章介紹了利用19F NMR研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。19F自旋量子數(shù)為1/2，自然

3、豐度是100％，磁旋比高，沒有背景信號干擾，靈敏度高，使用氟原子代替氫原子不會明顯的影響分子的結(jié)構(gòu)，19F核的多種特性使其成為研究生物學(xué)過程的有力工具。核磁共振能研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，功能，底物結(jié)合，構(gòu)象變化等信息。本章第一部分總結(jié)了氟核應(yīng)用于核磁共振的優(yōu)勢，接下來介紹了氟標記蛋白質(zhì)和多肽的合成原理和方法，最后重點介紹了結(jié)合19F NMR和氟標記探針方法在各領(lǐng)域中的應(yīng)用，包括研究蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)和功能、藥物的開發(fā)和篩選、代謝過程、生物活性

4、分子體內(nèi)追蹤等信息。
　　第三章描述了應(yīng)用位點特異性19F標記和19F NMR研究crude lysate蛋白質(zhì)間相互作用。我們成功的通過化學(xué)方法合成了非天然氨基酸三氟甲基苯丙氨酸，并利用19FNMR分析兩個促分裂原激活蛋白激酶(MAPKs): MEKK3和MEK5的PB1結(jié)構(gòu)域在天然細胞環(huán)境下蛋白質(zhì)間的相互作用。高度保守的MAPKs家族是一個參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要體系，其中比較重要的是參與從細胞膜到細胞核或細胞內(nèi)其它位置的信號傳遞。

5、MEKK3和MEK5在N端都含有一個PB1結(jié)構(gòu)域，它們通過形成二聚體發(fā)揮作用。我們將19F-tfmF分別插入到MEKK3-PB1和MEK5-PB1的不同位點，然后通過19F NMR化學(xué)位移變化和弛豫分析MEKK3-PB1和MEK5-PB1的相互作用界面，我們還證明了MEKK3-PB1和MEK5-PB1共純化樣品結(jié)合界面標記位點的化學(xué)位移變化與在細菌濃漿樣品(crude lysate)樣品中的變化一致。
　　第四章介紹利用19F固體

6、核磁共振來研究蛋白質(zhì)的磷酸化信息，以及在苯乙烯馬來酸酐（styrene maleic anhydride，SMA）作用下形成的脂碟(lipodisq)對細胞膜環(huán)境的改變。我們證實了苯乙烯馬來酸酐包裹形成的單層囊膜脂碟在膜蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能研究中的優(yōu)勢。餅狀膠束(bicelles)和納米碟(nanodiscs)，雖然也可以提高底物與膜蛋白的接觸幾率，但或需要特殊脂質(zhì)，或需要去污劑參與，或由于膜支架蛋白的影響，使其都不是最佳的研究介質(zhì)。Li

7、podisq一方面能維持完整的細胞膜環(huán)境，另一方面還可以提高底物與膜蛋白的接觸幾率，為利用19F固體核磁共振方法或者其它生物物理方法研究天然細胞膜環(huán)境下配體受體結(jié)合，酶學(xué)分析，蛋白質(zhì)間相互作用提供了便利。
　　第五章主要介紹小分子熒光探針的發(fā)展以及在生物學(xué)中的應(yīng)用，結(jié)合非天然氨基酸標記和小分子熒光探針L-(7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycine熒光壽命等熒光特性研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。