重組人非糖基化促紅細胞生成素的聚乙二醇定點修飾研究.pdf

1、促紅細胞生成素(Epo)是一種促進紅系造血前體細胞分化、繁殖的細胞因子，在臨床上主要用于治療慢性腎功能衰竭(CRF)、艾滋病人及腫瘤病人化療引起的貧血等，療效極為顯著。Epo是一種含有166個氨基酸的糖蛋白，糖基對于蛋白質的穩(wěn)定性維持和體內(nèi)活性至關重要。目前臨床使用的重組人促紅細胞生成素(rhEpo)均為中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達的糖蛋白，但CHO表達體系生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低，而大腸桿菌表達系統(tǒng)具有生長速度快、周期短、培養(yǎng)條件簡單、價

2、格低廉等優(yōu)點。雖然以大腸桿菌表達的無糖鏈促紅細胞生成素(rh-ngEpo)喪失了體內(nèi)生物活性，但是這一點可以通過PEG修飾技術來彌補。PEG修飾通過減少腎清除、降低免疫原性、減少酶解等改善蛋白藥物的藥代動力學性質，提高蛋白藥物的循環(huán)半衰期，增強體內(nèi)藥效，目前已成功用于多種蛋白藥物的長效制劑研發(fā)。
　　 為實現(xiàn)對蛋白質N末端的定點修飾和提高蛋白修飾后的活性保留，本文采用分子量為20 kDa和30 kDa的單甲氧基聚乙二醇-丙醛(m

3、PEG-ALD)對rh-ngEpo進行修飾。論文考察了各種反應條件對修飾效果的影響，得到了最佳反應條件，即在4℃時，20 mmol/LPB，0.5 mol/L甘露醇，pH6.0溶液中，蛋白濃度為1 mg/mL，PEG/rh-ngEpo摩爾比為10∶1，NaBH3CN/PEG摩爾比為10∶1，反應24 h后，單修飾率可達到55％。用一步離子交換色譜法對反應混合物進行分離純化，得到純度在95％以上的單修飾產(chǎn)物。
　　 對單修飾產(chǎn)物理

4、化性質和修飾位點進行研究，發(fā)現(xiàn)其二、三級結構與原蛋白一致。肽圖分析表明絕大部分的PEG修飾在了蛋白N-末端氨基酸殘基上。ELISA活性分析表明單修飾產(chǎn)物的體外活性比修飾前分別減少了30％和45.6％。穩(wěn)定性實驗表明PEG修飾顯著增強了原蛋白的熱穩(wěn)定性。藥代動力學實驗結果表明PEG提高了rh-ngEpo的代謝穩(wěn)定性。
　　 綜上所述，我們優(yōu)化了mPEG-ALD修飾rh-ngEpo的最佳反應條件，有效分離出單修飾產(chǎn)物，確定了偶聯(lián)產(chǎn)物