微孢根霉華根霉變種CICIM F0088生淀粉酶系的研究.pdf

1、本研究從各類樣品中分離得到365株具有淀粉水解能力的絲狀真菌并保藏于江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心,建立了一個絲狀真菌資源庫。從該資源庫中篩選出一株具有較強(qiáng)生淀粉水解能力的混合淀粉酶系產(chǎn)生菌株CICIM F0088。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察以及ITS序列同源性分析,確認(rèn)該菌株為微孢根霉的華根霉變種(Rhizopusmicrosporus var.chinens)。研究發(fā)現(xiàn)CICIM F0088菌株在固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵時所產(chǎn)生的淀粉酶量和淀粉

2、酶系的組成均存在差異。
　　 本文首次對Rhizopus microsporus var.chinensis在固態(tài)和液態(tài)兩種發(fā)酵方式下所產(chǎn)生的淀粉酶系進(jìn)行系統(tǒng)的研究和比較。經(jīng)過硫酸銨沉淀、雙水相分離、離子交換層析、制備電泳和凝膠過濾層析等五種純化方法,從CICIM F0088菌株的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到三個電泳純的酶蛋白GAA,GAB和AA,酶蛋白的分子量依次為53、52和55 kDa;采用硫酸銨沉淀、離子交換層析和制備電泳等三

3、種純化方法,從液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到兩個電泳純的酶蛋白GAC和GAD,酶蛋白分子量分別為53和52 kDa。
　　 對從CICIM F0088菌株分離純化得到的5個淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵時產(chǎn)生的葡萄糖淀粉酶GA A和GA B的溫度耐受范圍、pH耐受范圍以及生淀粉水解能力均優(yōu)于液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的GAC和GAD;上述四個葡萄糖淀粉酶都具有一定的生淀粉水解能力,而固態(tài)發(fā)酵時產(chǎn)生的α-淀粉酶AA不具有該能力。
　　

4、 結(jié)合Rhizopus屬來源的葡萄糖淀粉酶氨基酸保守序列及Rhizopus microsporus密碼子偏好性等信息設(shè)計簡并引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到CICIM F0088菌株葡萄糖淀粉酶編碼基因的部分DNA序列,再通過反向PCR獲得已知序列的側(cè)翼序列,最終獲得完整的編碼基因gluE。以此為基礎(chǔ),通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出了該基因完整的cDNA序列。通過比較gtuE基因的DN_A和cDNA序列發(fā)現(xiàn),gluE基因全長2763 bp,內(nèi)

5、部存在四個內(nèi)含子;該基因的cDNA全長1818 bp,其中信號肽編碼區(qū)81 bp,成熟肽編碼區(qū)共編碼579個氨基酸殘基。將成熟肽的氨基酸序列與GenBank中其他微生物來源的葡萄糖淀粉酶一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源性比對分析發(fā)現(xiàn),該酶與所有已知葡萄糖淀粉酶的最高同源性為80％,是一種新的葡萄糖淀粉酶。
　　 將葡萄糖淀粉酶基因gluE的cDNA序列連入pET-28a(+)表達(dá)載體,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-gluE,在Escherich