羰基還原酶的半理性設計及其催化合成孟魯司特鈉-依折麥布中間體.pdf

1、孟魯司特鈉是治療哮喘的白三烯受體拮抗劑代表藥物，依折麥布是一種膽固醇吸收抑制劑，都具有良好的市場前景。近年來，利用生物催化劑不對稱還原前體酮合成手性醇成為國內外研究的熱點。本文利用計算機模擬確定突變位點，在此基礎上對一種對孟魯司特鈉手性中間體前體酮具有還原活性的羰基還原酶的改造進行了研究;發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌對依折麥布手性醇具有不對稱還原合成活性。主要工作如下:
　　將對孟魯司特鈉手性中間體前體酮的具有還原活性的羰基還原酶(kred)基

2、因連接到pET22b質粒和pPIC9K質粒中，分別在大腸桿菌和畢赤酵母GS115進行蛋白表達，使用粗酶液作為生物催化劑不對稱還原合成(S，E)-2-[3-[3-[2-（7-氯喹啉）乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯與(S，E)-1-[3-[2-（7-氯-2-喹啉基）乙烯基]苯基]-3-[2-[2-羥基-2-基]苯基]丙-1-醇（孟魯司特鈉的兩個手性中間體），目標產物ee值＞99％。
　　對kred進行同源建模(swiss-m

3、odel)，應用Discovery Studio2.5完成受體配體對接。分析輔酶及底物結合口袋，基于結構特點分析，對酶分子進行定點突變。發(fā)現(xiàn)209位點突變后，酶活提高了1.2倍。pET22b-kred(R209A)大腸桿菌重組菌誘導表達的蛋白對2-[3-[3-[2-（7-氯喹啉）乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯的活性是對2-[3-[3-[2-（7-氯喹啉）乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯基-2-丙醇活性1.35倍，應用Disco

4、very studio模擬突變酶與兩種底物的對接并計算能量，結果發(fā)現(xiàn)酶與前者對接后能量較小，模擬結果與實驗結果相一致。
　　發(fā)現(xiàn)大腸桿菌全細胞作為生物催化劑對依折麥布手性中間體前體酮具有不對稱還原活性，產物(4S)-3-[(5S)-5-（4-氟苯基）-5-羥基戊酰基]-4-苯基-1，3-氧氮雜環(huán)戊烷-2-酮ee值為99.99％，轉化率為70％。對此全細胞反應條件進行了優(yōu)化，結果表明，最佳反應溫度為35℃，最佳反應的pH值為7，1m