水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分離鑒定及部分菌株的耐藥性研究.pdf

1、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,簡(jiǎn)稱V.p),又稱嗜鹽菌,屬于弧菌科,弧菌屬。目前在細(xì)菌性食物中毒中,由副溶血性弧菌引起的比例比較高,其危害程度也是很大的,僅次于大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌,該菌常存在于海水、海產(chǎn)品、海底沉積物、熟肉及鹽漬食品中,主要引起人的食物中毒,表現(xiàn)為嘔吐、急性腹瀉,在東南亞、日本、美國(guó)及我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)比較多見,在我國(guó)沿海地區(qū)食物中毒中也是最常見的致病菌。隨著人們生活水平的提高,全

2、球?qū)λa(chǎn)品安全性更加重視,特別是近幾年來,由于海產(chǎn)品在內(nèi)地城市盛行,內(nèi)地水產(chǎn)品安全事件也頻繁發(fā)生,危害程度也日益嚴(yán)重,已經(jīng)引起人們的高度重視。本研究共收集副溶血性弧菌可疑陽(yáng)性病料30份,共分離出30株疑似菌株,并對(duì)所分離的疑似菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、血清學(xué)分型、耐鹽性試驗(yàn),并對(duì)其中5株在分子水平上進(jìn)行了16SrRNA序列分析,同時(shí)對(duì)不同血清型的6個(gè)本地株進(jìn)行了耐藥性試驗(yàn)。以期為進(jìn)一步研究副溶血性弧菌感染的臨床治療和公共衛(wèi)生學(xué)意義

3、提供參考依據(jù),同時(shí)對(duì)現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)預(yù)防和治療副溶血性弧菌都具有指導(dǎo)意義。
　　 本課題主要研究?jī)?nèi)容:
　　 (一)收集副溶血性弧菌可疑陽(yáng)性病料30份:小龍蝦樣品16份,魚類樣品10份,貝類樣品4份(這些樣品來自鄭州地區(qū)不同海產(chǎn)品市場(chǎng)隨機(jī)取樣所得),進(jìn)行前增兇培養(yǎng),并用TCBS培養(yǎng)基和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性分離培養(yǎng),共分離出30株疑似菌株。通過對(duì)30株疑似菌株進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性等觀察及用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀(VITE

4、K-32)進(jìn)行生化鑒定,初步判定30株疑似菌均為副溶血性弧菌。
　　 (二)檢測(cè)本地流行株的血清型,不僅對(duì)血清流行病學(xué)具有一定的意義,而且在對(duì)副溶血性弧菌引起的疾病的特異性免疫診斷與防疫方面也具有一定的參考價(jià)值。本研究參照GB/T478917—2003技術(shù)規(guī)程,采用玻片凝集方法,用標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)30株分離菌進(jìn)行了血清學(xué)試驗(yàn)。結(jié)果表明測(cè)試的30株副溶血性弧菌主要分屬于01和05兩個(gè)血清群,分別占60％(18/30)和40％(12/30

5、)。30株試驗(yàn)菌共分6種血清型:01:K3、01:K4、01:K6、01:K7、05:K9、05:K4。
　　 (三)16SrRNA基因序列分析已經(jīng)成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究選取5株代表性菌株(小龍蝦病料分離出的2株、魚類病料分離出的2株、貝類病料分離山的1株),通過設(shè)計(jì)上游引物(5’-GACTCAACACAAGAAGAGATGC-3’),下游引物(5’-ATGCGTGACATCCCAGAAC-3’),用PCR方法

6、分別克隆了其16SrRNA基因序列,根據(jù)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究參考相關(guān)文獻(xiàn),采用DNA—Star中的MEGAversion軟件,依靠Kimura2-PameterDistance分析方法對(duì)疑似菌株和己發(fā)表菌株進(jìn)行分析比較,用Neighbor-Joining構(gòu)建分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明所測(cè)序列與己發(fā)表的副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA序列具有高達(dá)99％的相似性。對(duì)比弧菌屬相關(guān)菌株的16SrRNA序列和對(duì)分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,確