重組狂犬病病毒的拯救及其礦化疫苗的生物學(xué)特性研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)感染引起的以侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的致死性人畜共患傳染病。RABV可以感染人及所有溫血?jiǎng)游?，引起狂犬病，一旦發(fā)病致死率幾乎可達(dá)100％。
　　本研究利用反向遺傳操作，通過(guò)將綠色熒光蛋白(GFP)基因克隆到狂犬病病毒載體的N和P基因之間，并且在Vero E6細(xì)胞上進(jìn)行重組病毒拯救，成功的拯救出攜帶GFP基因的重組狂犬病病毒rSAD-GFP，并對(duì)重組病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。通

2、過(guò)測(cè)定病毒滴度，繪制生長(zhǎng)曲線，病毒滴度測(cè)定結(jié)果表明重組病毒與親本病毒在Vero E6細(xì)胞的生長(zhǎng)特性基本一致，兩種病毒生長(zhǎng)沒(méi)有顯著性差異;重組病毒在Vero細(xì)胞連續(xù)傳代數(shù)代，未發(fā)現(xiàn)外源基因丟失的現(xiàn)象。將拯救的重組病毒rSAD-GFP通過(guò)腦內(nèi)注射的方法感染BALB/C小鼠，通過(guò)該試驗(yàn)評(píng)價(jià)重組病毒的致病性，小鼠在重組病毒攻擊后，無(wú)可見(jiàn)的臨床癥狀和死亡現(xiàn)象，表明拯救的重組病毒屬于弱毒毒株。在構(gòu)建rSAD-GFP毒株成功的基礎(chǔ)上，我們利用該質(zhì)粒，

3、構(gòu)建含有礦化基因W6的重組質(zhì)粒，并對(duì)外源礦化基因的插入位置進(jìn)行了一系列的研究，獲得了不同的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，但是未能拯救成功。該礦化基因插入位置對(duì)病毒的拯救存在影響，而狂犬病毒含有囊膜，也是拯救過(guò)程中的一個(gè)障礙，并且有研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)的天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)存在導(dǎo)致的強(qiáng)負(fù)電荷性多肽插入困難，這種情況下病毒也很難拯救成功。
　　介孔納米二氧化硅是一種外表有很多像蜂巢孔一樣的小孔，中間卻是空心的，類似蜂巢狀的結(jié)構(gòu)使得

4、二氧化硅顆?？梢酝ㄟ^(guò)氫鍵、離子鍵作用、靜電作用、疏水作用力與蛋白質(zhì)結(jié)合，介孔二氧化硅可以負(fù)載病毒抗原，保護(hù)病毒抗原。本研究試圖將介孔納米二氧化硅作為體外礦化候選佐劑，將重組狂犬病病毒rSAD-GFP滅活抗原與介孔納米二氧化硅按一定的比例混合，研究介孔二氧化硅作為疫苗佐劑對(duì)重組狂犬病疫苗的理化性質(zhì)的影響，并通過(guò)M-ABT（抗原含量測(cè)定方法）檢測(cè)疫苗中糖蛋白含量變化。
　　利用BALB/C小鼠模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)重組病毒滅活抗原的免疫效價(jià)和

5、以介孔納米二氧化硅為佐劑的疫苗免疫特性。ELISA法檢測(cè)血清抗RABV G蛋白IgG抗體，RFFIT檢測(cè)血清中和抗體。同時(shí)，取21和28日齡的小鼠脾臟用于ELISPOT以分析IL-4和IFN-γ的分泌水平;在28天用30個(gè)LD50的CVS對(duì)小鼠進(jìn)行腦內(nèi)攻毒，評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)效力，結(jié)果顯示介孔納米二氧化硅佐劑可以有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示單純的抗原保護(hù)率可以達(dá)到70％，與佐劑混合的抗原保護(hù)率可以達(dá)到100％。介孔納米Si