海參體壁中膠原蛋白酶的研究.pdf

1、海參（Sea cucumber,holothurians）以其高營養(yǎng)價值并極具藥用價值而成為重要的海洋經(jīng)濟(jì)動物。當(dāng)海參受到一定的外界刺激時很容易發(fā)生自溶現(xiàn)象，給其保鮮、貯藏、運(yùn)輸和加工等環(huán)節(jié)帶來諸多問題，并造成資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。體壁作為海參的主要可食部分，主要由膠原蛋白和酸性粘多糖組成。海參的自溶與其體內(nèi)蛋白酶的作用密切相關(guān)。但是，目前對于海參自溶過程中能夠引起膠原蛋白降解的蛋白酶的種類和性質(zhì)了解甚少。本文以刺參（Stichopus

2、japonicus）為研究對象，研究其體壁中膠原蛋白酶的存在情況，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)膠原蛋白酶的高度純化并對其性質(zhì)進(jìn)行深入分析，為闡明海參膠原蛋白的代謝機(jī)制和海參自溶機(jī)理等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。
　　通過測定不同蛋白酶抑制劑對海參體壁粗酶液降解其膠原蛋白能力的抑制作用，發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶抑制劑EDTA，EGTA和1,10-phenanthroline能夠強(qiáng)烈抑制海參體壁粗酶液對膠原蛋白的降解，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和Benzamidin

3、e對膠原蛋白的降解有輕微的抑制作用，其它蛋白酶抑制劑無明顯影響。因此，推測在海參體壁中存在著能夠分解膠原蛋白的金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。
　　通過硫酸銨鹽析、DEAE-Sephacel離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析、Q-Sepharose離子交換層析和Phenyl-Sepharose疏水層析等方法，首次從海參體壁中純化得到一種金屬蛋白酶（Metalloproteinase,MP）。SDS-PAGE和明膠酶

4、譜結(jié)果顯示MP的分子量約為45kDa，酶在弱堿性pH范圍內(nèi)（8.0~9.0）表現(xiàn)出較高活性，最適溫度在40~45°C之間。金屬蛋白酶抑制劑可明顯抑制其活性，其他蛋白酶抑制劑對MP活性則沒有明顯影響。質(zhì)譜分析得到3個肽段共58個氨基酸殘基，與假單胞菌堿性金屬蛋白酶同源性較高（91.4%），證明純化的目的蛋白是一種金屬蛋白酶。Ca2+能夠顯著影響MP活性，表明它是一種Ca2+依賴性金屬蛋白酶。MP不僅在37°C，甚至在4°C都可以有效降解海

5、參膠原蛋白，推測其很可能是參與海參自溶過程中降解膠原蛋白的一種重要蛋白酶。
　　通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sephacel離子交換層析、SephacrylS-200凝膠過濾層析、Q-Sepharose離子交換層析，從海參體壁中純化到一種絲氨酸蛋白酶（Serine proteinase,SP）。SP的分子量約為30kDa，SP的最適溫度和最適pH分別為45°C和9.0。絲氨酸蛋白酶抑制劑Chymostatin,Pefabloc SC

6、等可明顯SP活性，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64也有一定的抑制作用，而其他類型抑制劑對其活性沒有明顯影響。該酶分解熒光底物Boc-Leu-Lys-Arg-MCA的活性最高，米氏常數(shù)Km和kcat值分別為5.507μmol/L和0.6s-1。SP對海參膠原蛋白同樣具有較明顯的分解作用，因此推測其可能也參與海參自溶過程中對膠原蛋白的降解。
　　蛋白酶種類繁多，參與機(jī)體新陳代謝，在生物體生命活動中發(fā)揮著重要作用。本文以刺參為研究對象，首次