基于WAVE生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮微載體培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞PC-3條件優(yōu)化.pdf

1、目的:
　　通過轉(zhuǎn)瓶將PC-3細(xì)胞大量擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)入2L WAVE生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模微載體懸浮培養(yǎng)。通過胰酶消化及細(xì)胞再次貼壁微載體在生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)微載體上細(xì)胞球轉(zhuǎn)球擴(kuò)大培養(yǎng)。建立起一整套從轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)到生物反應(yīng)器中微載體懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)體系。為前列腺癌疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持。
　　方法:
　　1.轉(zhuǎn)瓶中貼壁培養(yǎng)PC-3細(xì)胞條件優(yōu)化。
　　在850cm2轉(zhuǎn)瓶中貼壁培養(yǎng)PC-3細(xì)胞，擴(kuò)增細(xì)胞

2、數(shù)量，從而培養(yǎng)出足夠數(shù)量的細(xì)胞并在WAVE生物反應(yīng)器上進(jìn)行大規(guī)模微載體懸浮培養(yǎng)。摸索轉(zhuǎn)瓶中貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞接種密度，通過計(jì)數(shù)未貼壁的細(xì)胞密度來計(jì)算細(xì)胞在不同轉(zhuǎn)速下的貼壁率，從而得出在轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)速對(duì)于細(xì)胞貼壁及后續(xù)生長(zhǎng)傳代的影響。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　2.小規(guī)模微載體靜止培養(yǎng)PC-3細(xì)胞條件優(yōu)化。
　　在細(xì)菌培養(yǎng)皿中分別接種3×105cells/mL、5×105cells/mL及7×105cells/mL的細(xì)

3、胞密度，加入過量的微載體供細(xì)胞貼壁。每24h監(jiān)測(cè)葡萄糖濃度及細(xì)胞密度，根據(jù)葡萄糖代謝曲線及細(xì)胞生長(zhǎng)速度，探索最適的細(xì)胞接種密度及在該密度下細(xì)胞培養(yǎng)模式、換液方式。在最佳細(xì)胞接種密度的基礎(chǔ)上選擇2g/L、3g/L、4g/L及5g/L的微載體濃度做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞增長(zhǎng)情況對(duì)比判斷最佳微載體濃度。對(duì)比細(xì)胞在微載體上不經(jīng)胰酶消化直接加入新的微載體，通過細(xì)胞間的“橋聯(lián)”作用實(shí)現(xiàn)微載體上細(xì)胞球轉(zhuǎn)球擴(kuò)大培養(yǎng)與消化10min、15min、20min、及

4、30min后再加入新的微載體使細(xì)胞重新貼壁的球轉(zhuǎn)球擴(kuò)大培養(yǎng)效果。經(jīng)兩種放大培養(yǎng)方式處理后再培養(yǎng)四天，對(duì)比細(xì)胞生長(zhǎng)速度及最后收獲的細(xì)胞數(shù)量，最終確定最佳的培養(yǎng)方案。為WAVE生物反應(yīng)器上大規(guī)模培養(yǎng)提供參考。
　　3.WAVE生物反應(yīng)器上大規(guī)模懸浮微載體培養(yǎng)PC-3細(xì)胞條件優(yōu)化。
　　在WAVE生物反應(yīng)器400mL培養(yǎng)體積條件下，以5×105cells/mL的初始細(xì)胞接種密度為基礎(chǔ)再一次探索3g/L、4g/L及5g/L微載體濃度

5、對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，每24h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抽樣，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況、檢測(cè)葡萄糖濃度，計(jì)數(shù)細(xì)胞并繪制細(xì)胞密度曲線。同時(shí)根據(jù)小規(guī)模培養(yǎng)時(shí)的消化結(jié)果，在WAVE生物反應(yīng)器中對(duì)細(xì)胞消化15及20min并加入新的微載體繼續(xù)培養(yǎng)，觀察不同的消化時(shí)間對(duì)于細(xì)胞后續(xù)貼壁及生長(zhǎng)傳代的影響，并與不消化直接加微載體進(jìn)行細(xì)胞球轉(zhuǎn)球擴(kuò)大培養(yǎng)方式做對(duì)比，從而選擇最佳的細(xì)胞球轉(zhuǎn)球擴(kuò)大培養(yǎng)方案，為大規(guī)模制備前列腺癌腫瘤疫苗奠定基礎(chǔ)。將培養(yǎng)結(jié)束后收獲的細(xì)胞固定，錨定GM-CSF與

6、TNF-a兩種蛋白制備成腫瘤疫苗并檢測(cè)疫苗的錨定率。
　　結(jié)果:
　　1.建立起轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)PC-3細(xì)胞的新方法，篩選出2×105cells/mL為最佳起始接種密度（在200mL的培養(yǎng)體積中細(xì)胞起始接種數(shù)量為4×107cells），并確立在轉(zhuǎn)瓶中連續(xù)培養(yǎng)4天的貼壁培養(yǎng)方式。探索出細(xì)胞貼壁的最佳起始轉(zhuǎn)速為4rph，根據(jù)先慢后快的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)模式[1]，在培養(yǎng)的第三天將轉(zhuǎn)瓶的轉(zhuǎn)速調(diào)整為6rph取得了良好的效果，培養(yǎng)四天后單個(gè)轉(zhuǎn)瓶

7、的細(xì)胞數(shù)量最高可達(dá)8-10×107cells。
　　2.在小規(guī)模微載體靜止培養(yǎng)條件下，根據(jù)葡萄糖濃度和細(xì)胞密度變化曲線，將5×105cells/mL作為細(xì)胞初始接種密度。同時(shí)根據(jù)不同微載體濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)比結(jié)果，選擇3g/L或4g/L作為最適微載體濃度。通過對(duì)不消化直接加入新載體與消化不同時(shí)間后再加入新微載體兩種細(xì)胞球轉(zhuǎn)球擴(kuò)大培養(yǎng)方式的對(duì)比，最終確定在胰酶消化15或20min后再加入微載體更有利于細(xì)胞后續(xù)生長(zhǎng)。
　　3.在

8、WAVE生物反應(yīng)器中，通過5度、8rpm擺動(dòng)2min，靜止培養(yǎng)20min的循環(huán)培養(yǎng)模式進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。在5×105cells/mL起始細(xì)胞接種密度條件下，選擇3g/L的微載體濃度做為最適濃度。根據(jù)WAVE生物反應(yīng)器中胰酶消化后微載體球轉(zhuǎn)球擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)果，最終選擇經(jīng)胰酶消化20min做為最佳消化時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在WAVE生物反應(yīng)器中微載體球轉(zhuǎn)球擴(kuò)大培養(yǎng)。最終在2L生物反應(yīng)器中細(xì)胞密度達(dá)到1.3×106cells/mL，細(xì)胞總量可達(dá)