抗兔腹瀉芽孢桿菌Tu-569菌株的篩選、發(fā)酵與應用.pdf

1、從成年健康肉兔的盲腸中篩選出對大腸桿菌(Escherichiacoli)等腹瀉致病菌有較強抑制作用的抗腹瀉芽孢桿菌,初步探討其飼喂效果。以大腸桿菌、沙門氏菌和痢疾桿菌為指示菌進行初篩和復篩,選擇抑制大腸桿菌活性較強的菌株;然后考察菌株對膽酸鹽、胃腸道環(huán)境和高溫環(huán)境的耐受性,考察菌株對抗生素的敏感性,評價其安全性;經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化試驗和16SrDNA全序列分析鑒定菌株的種屬。從健康肉兔的盲腸中篩選到能抑制大腸桿菌、沙門氏菌和痢疾桿菌

2、等致腹瀉病原菌的菌株Tu-569,經(jīng)過鑒定其為Bacillusvelezensis,該菌株具有良好的溫度耐受性,耐受0.4％膽酸鹽,在胃腸道環(huán)境中能夠正常生長繁殖,對中劑量的硫酸鏈霉素、土霉素、硫酸慶大霉素敏感,對中劑量的二甲氧芐啶、呋喃唑酮和磺胺脒耐受,且對幼兔安全,具有作為飼料添加劑飼喂幼兔的潛力。
　　 對影響Tu-569菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的碳源、氮源、無機鹽進行單因素試驗以選擇合適的種類,通過正交試驗確定培養(yǎng)基組成;對影響T

3、u-569菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件如溫度、裝瓶量、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、發(fā)酵時間進行正交試驗,以確定該菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的最適條件。最佳的產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件為培養(yǎng)基組成為1.5%可溶性淀粉、2.0%蛋白胨、0.07%MnSO4·H2O、0.05%MgSO4·7H2O,發(fā)酵時間為24h,裝瓶量為50mL/250mL,接種量為2%,pH值為5.0。在該條件下,BacillusvelezensisTu-569菌株產(chǎn)抑菌多肽的能力顯著

4、提高,抑菌圈面積為322mm2,抑菌圈面積為未優(yōu)化前的2.1倍。
　　 BacillusvelezensisTu-569菌株胞外產(chǎn)抑菌物為分子量在3.5-8kD之間的多肽類,可被飽和度60%的硫酸銨鹽析;該抗菌肽熱穩(wěn)定性較好,但可被蛋白酶降解;采用正丁醇萃取該抗菌肽不會降低其活性;其活性可被Mn2+離子增強,但在強酸(pH3)強堿(pH11)環(huán)境中會大幅度降低;當存在表面活性劑和β-巰基乙醇時,抗菌肽抑菌活性完全喪失。每1mg粗

5、蛋白中含有的抗菌肽抑制大腸桿菌的能力相當于2μg硫酸慶大霉素、10μg硫酸鏈霉素或50μg土霉素:該抗菌肽性質(zhì)穩(wěn)定,具有較高的抗菌活性,在畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、食品等領域中有一定的應用價值。
　　 對發(fā)酵液離心得到的上清液進行60%硫酸銨鹽析,透析后凍干;通過DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析,改變影響分離效果的緩沖體系pH,對抗菌肽進行初步的分離純化,結(jié)合SDS-PAGE等方法,對具有較強抑菌活性的組分進行純

6、度分析。結(jié)果表明,采用pH7.2的緩沖體系,可獲得對大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌具有較強抑制作用的洗脫峰3,結(jié)合TricineSDS-PAGE證實,洗脫峰3由相對分子質(zhì)量約7.8kDa的主要成分和相對分子質(zhì)量高于20.1kDa的次要成分組成。對Tu-569菌株產(chǎn)抗菌多肽分離純化方法的初步探索為抗菌肽的純化及結(jié)構(gòu)測定奠定了基礎,有利于其抑菌機制研究的開展。
　　 將BacillusvelezensisTu-569菌株發(fā)酵液按不同比

7、例拌料飼喂幼兔,進行小規(guī)模飼喂試驗,檢測生長性能指標、腹瀉率及死淘率;分別于第7d、第14d、第21d和第28d取新鮮的糞便,測定糞便中的纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等多種消化酶活力;用傳統(tǒng)微生物方法通過不同的選擇性培養(yǎng)基檢測糞便中芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和大腸桿菌數(shù)量,同時提取糞便中的總DNA通過ERIC-PCR做出腸道菌落多態(tài)性指紋圖譜,用Quantityone4.6.2軟件對圖譜進行分析計算糞便中菌群的多樣性指數(shù);飼喂28d后

8、,耳緣靜脈取血,檢測血常規(guī)指標;對幼兔進行解剖,取其心、肝、脾、胃、腎和胸腺,通過重量、顏色和質(zhì)地的變化判斷其是否健康。結(jié)果表明,不同組間的兔子的耳長、耳寬、體長、胸圍沒有差異;添加15mL/100g的Tu-569菌液量,幼兔采食量與對照組幼兔沒有差異,但此時具有最低的耗料增重比和最大的飼料轉(zhuǎn)化率。添加15mL/100g或25mL/100g的Tu-569菌液可有效預防腹瀉,且不會導致幼兔死亡。添加Tu-569菌液會使白細胞、紅細胞、血紅

9、細胞、淋巴細胞百分比、單核細胞百分比等指標發(fā)生顯著差異,其余各指標無顯著差異。添加15mL/100g的Tu-569菌液會顯著增加脾重、胸腺重,對幼兔免疫機能產(chǎn)生一定影響。添加Tu-569菌液可縮短達到菌群平衡所需的時間,提高菌群平衡時芽孢桿菌、酵母菌、乳酸桿菌的數(shù)量,減少并維持較低水平的大腸桿菌。采用15mL/100g可使幼兔腸道內(nèi)較早的呈現(xiàn)微生物菌群多樣化。添加15mL/100g的Tu-569菌液能夠提高幼兔腸道內(nèi)的各種消化酶活力,促