脂氧素A4通過增強LXRα途徑上調(diào)THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中ABCA1的表達.pdf

1、目前對動脈粥樣硬化的治療主要是以他汀類等降脂藥為主，但研究表明他汀類藥物只對20％-40％的動脈粥樣硬化患者起作用，并且可損傷肝臟以及導(dǎo)致橫紋肌溶解，尋找新的和有效的防治動脈粥樣硬化的藥物是非常重要和緊迫的。
　　目的:
　　本實驗采用與膽固醇代謝密切相關(guān)的THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞進行研究，旨在觀察LXA4對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響。本研究發(fā)現(xiàn)在THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中，無論在基因水平還是蛋白水

2、平，LXA4能濃度依賴性上調(diào)ABCA1的表達并促進細胞內(nèi)膽固醇的流出，從而抑制泡沫細胞的形成，并且這一過程依賴于LXRα途徑。本次研究的結(jié)果為LXA4可能成為調(diào)控膽固醇代謝的藥物提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、細胞培養(yǎng)
　　(1) THP-1細胞靜置培養(yǎng):RPMI-1640培養(yǎng)基加入10％新生胎牛血清混勻，同時在培養(yǎng)液中加100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素，放置37℃、5％C02和濕度為100％的細胞

3、培養(yǎng)箱中孵育。待細胞生長狀態(tài)良好時，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。(2)誘導(dǎo)分化:加入100ng/ml濃度的佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)刺激THP-1細胞，誘導(dǎo)成為巨噬細胞;再加入濃度為50μg/ml的Ox-LDL誘導(dǎo)其成為泡沫細胞。(3)細胞轉(zhuǎn)染:將細胞接種于6孔板中，待細胞融合度為80～90％時，按照lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染步驟將siRNA轉(zhuǎn)染到泡沫細胞，轉(zhuǎn)染48

4、h后進行后續(xù)實驗。
　　2、氧化型低密度脂蛋白(oxidize low density lipoprotein，Ox-LDL)的準備
　　將2001μg/ml低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)溶液加入含硫酸銅的磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer, PBS)中進行氧化，37℃條件下孵育24小時。加入含200mM乙二胺四乙酸(ethylene dinitrilotetraacet

5、ic acid, EDTA)的PBS溶液終止其氧化反應(yīng)。然后在37℃下用PBS透析48小時以去除Cu2+，再用0.22μm孔徑的濾器過濾除菌，最后用BCA試劑定量蛋白濃度，并將濃度調(diào)至1g/L，4℃保存?zhèn)溆谩Ｆ渲?，新制備的Ox-LDL保存在含50 mM Tris-HC1，0.15 M NaCl and2.0 mM EDTA的混合液中，其保存的pH為7.4，并在使用前十天之內(nèi)準備。
　　3、RNA提取和實時熒光定量PCR
　　

6、按照TRIzol試劑盒提取THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的總RNA，用紫外分光光度計(Thermo，NanoDrop2000)進行RNA濃度的檢測。將1μg總RNA用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在普通PCR儀中反轉(zhuǎn)錄成201μl cDNA。在ABI7500 FAST上進行實時定量PCR來擴增模板量，參照溶解曲線來分析PCR反應(yīng)的特異性，以GAPDH表達量為內(nèi)參并以ΔΔCt方法定量mRNA的相對表達量。
　　4、免疫印跡(Western

7、 blot analyses)
　　采用凱基蛋白提取試劑盒提取蛋白，采用BCA試劑檢測蛋白濃度;對蛋白提取物定量后向剩余的蛋白提取物中加入其五分之一體積的5×SDS，混勻并煮沸10分鐘，冷卻后置-20℃待用。8％瓊脂糖凝膠電泳分離目的蛋白ABCA1以及10％瓊脂糖凝膠電泳分離目的蛋白LXRα，然后按說明書要求依次電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以兔多克隆抗ABCA1、LXRα和β-actin一抗孵育過夜，洗滌孵育二抗再洗滌后，以化學(xué)發(fā)光法顯示條帶

8、，檢測目的蛋白的相對表達量。
　　5、轉(zhuǎn)染小分子RNA
　　THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞接種在6孔板中（2×106/孔），待細胞密度達到80％至90％時，用lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染LXRα-siRNA和空載siRNA。孵育37℃，48h后，用Trizol提取總RNA用于mRNA檢測，用凱基蛋白提取試劑盒提取蛋白用于免疫印跡的檢測。
　　6、高效液相色譜分析
　　待細胞處理結(jié)束后，用加樣槍吸

9、去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞3遍，然后加入200μl的細胞裂解液，反復(fù)凍融3次，保證細胞裂解充分。采用BCA法檢測蛋白濃度，然后加入濃度為7.2％的三氯乙酸來沉淀蛋白，放置片刻后在普通離心機以800×g的轉(zhuǎn)速離心10min，吸取上清至新的EP管進行膽固醇檢測，以豆甾醇為內(nèi)標。其中取100μl上清液來進行總膽固醇的檢測，在這100μ1上清液加入200μl濃度為8.9mol/L的氫氧化鉀溶液來水解膽固醇酯，水解膽固醇酯后的樣品即為細胞內(nèi)總膽

10、固醇檢測樣品。各樣品分別與內(nèi)標液混勻，加入正己烷和無水乙醇進行抽提，再用濃度為1.5mol/L的三氧化鉻進行氧化衍生并真空干燥，最后加入100μl乙晴-異丙醇(80∶20)溶解樣品，上樣于高效液相色譜儀。采用C-18柱，柱溫4℃，流速1mL/min，250nm紫外光檢測，膽固醇以峰面積定量，內(nèi)標校準。
　　7、膽固醇流出實驗
　　待用LXA4或siRNA-LXRα處理細胞結(jié)束后，在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中

11、加入0.2uCi/mL[3H]標記的膽固醇并共同孵育細胞，待細胞長至85％時，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞，再用含載脂蛋白A1(apolipoproteinA1，apoA1)而不含胎牛血清RPMI-1640的培養(yǎng)液孵育細胞。24h后，收集細胞培養(yǎng)液;并經(jīng)PBS洗滌細胞后用閃爍液裂解細胞，用閃爍計數(shù)法分別檢測培養(yǎng)液和細胞中的[3H]膽固醇，單位為CPM。膽固醇流出率用培養(yǎng)液中CPM除以總CPM(培養(yǎng)液CPM+細胞CPM)，再乘以100％來表

12、示。
　　8、統(tǒng)計分析
　　采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表示為:均數(shù)±標準差((x)±s)。兩組間各基因mRNA相對表達量、各蛋白免疫印跡條帶相對灰度值的比較采用兩獨立樣本t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析。每組實驗重復(fù)3次，統(tǒng)計結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、LXA4上調(diào)THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中ABCA1的表達。
　　動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展是巨噬細胞、內(nèi)

13、皮細胞和平滑肌細胞相互作用導(dǎo)致的結(jié)果。已有研究表明LXA4能夠影響內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)和平滑肌細胞的增殖遷移，提示LXA4與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。巨噬細胞源性泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化的主要病理過程之一，并且ABCA1是一個膜整合蛋白，在膽固醇代謝中起著重要的作用，因此我們首先探討LXA4是否影響THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中ABCA1的表達。我們采用0nM，1nM，10nM和100nM等不同濃度梯度的LXA4刺激THP-1巨噬細

14、胞源性泡沫細胞，分別采用熒光定量PCR和免疫印跡檢測各組細胞中ABCA1的表達。結(jié)果顯示LXA4在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平可濃度依賴性上調(diào)ABCA1的表達。
　　2、LXA4上調(diào)THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中LXRα的表達。
　　LXRα是配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，是個膽固醇代謝相關(guān)的重要分子，在維持膽固醇的平衡中具有重要的調(diào)控作用。為了進一步觀察LXA4對膽固醇代謝的影響，我們接下來探討LXA4是否影響細胞中L

15、XRα的表達。我們采用不同濃度0nM，1nM，10nM和100nM的LXA4刺激THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞，實時熒光定量PCR和免疫印跡檢測各組細胞中LXRα的表達。結(jié)果顯示，無論在基因水平，還是在蛋白水平，LXA4可濃度依賴性上調(diào)LXRα的表達。
　　3、LXRα途徑介導(dǎo)了LXA4對ABCA1的上調(diào)作用。
　　上述結(jié)果表明LXA4能同時上調(diào)ABCA1和LXRα的表達，并且眾多研究表明ABCA1是LXRα調(diào)控的主要靶基因

16、之一，因此我們推測在THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中LXA4可能通過LXRα途徑上調(diào)ABCA1的表達。我們采用小分子RNA干擾技術(shù)敲減LXRα基因，結(jié)果顯示LXRα表達量減少了88％。LXRαsiRNA處理細胞后，LXA4對ABCA1的上調(diào)作用被抑制，表明LXA4通過LXRα途徑上調(diào)ABCA1的表達。
　　4、LXA4通過LXRα途徑促進細胞內(nèi)膽固醇流出和降低膽固醇含量。
　　ABCA1是一種整合膜蛋白，主要參與膽固醇的逆向

17、轉(zhuǎn)運，它能夠作為通道促進細胞內(nèi)膽固醇流出并與細胞外的ApoA1結(jié)合，從而將過量的膽固醇運輸至肝臟進行代謝。上述結(jié)果表明LXA4可以上調(diào)ABCA1的表達，因此我們接著觀察LXA4對細胞中膽固醇流出的影響。與對照組相比，LXA4能夠促進細胞內(nèi)膽固醇流出;而干擾LXRα表達后，與對照組相比，LXA4處理對細胞內(nèi)膽固醇流出影響差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣的，與對照組相比，LXA4能降低細胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯的含量;而干擾LXRα表達后

18、，與對照組相比較，LXA4處理對細胞內(nèi)膽固醇含量影響差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明LXA4通過LXRα途徑促進細胞內(nèi)膽固醇流出和降低細胞內(nèi)膽囤醇含量。
　　結(jié)論:
　　1、LXA4濃度依賴性上調(diào)THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中ABCA1表達。
　　2、LXA4濃度依賴性上調(diào)THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中LXRα表達。
　　3、LXA4通過LXRα途徑上調(diào)THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中ABCA1的表達。