Gsk-3β在正畸牙齒移動過程中對巨噬細胞極化的影響.pdf

1、正畸牙齒移動是個非常復(fù)雜的過程，包括軟組織適應(yīng)性變化，骨組織改建，血液及相關(guān)因子的變化。其中最主要的是骨組織的變化，而骨組織變化與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。骨組織的適應(yīng)性變化包括壓力側(cè)，發(fā)生炎癥反應(yīng)，促進破骨相關(guān)細胞活動從而產(chǎn)生骨質(zhì)破壞，是正畸牙齒進行移動的前提；張力側(cè)則相反，由于張力的刺激，進而促進成骨相關(guān)細胞的活動，從而骨質(zhì)形成。Macrophage（巨噬細胞）作為固有免疫的重要細胞在炎癥反應(yīng)中具有重要意義，并且有文章指出macrophag

2、e在骨質(zhì)改建過程中有重要意義，作為單核-巨噬細胞系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)變?yōu)槠乒羌毎M而調(diào)節(jié)破骨活動。Macrophage根據(jù)其作用劃分為M1和M2兩型macrophage，這兩種細胞在各種理化環(huán)境下能相互轉(zhuǎn)換。當機體發(fā)生炎癥時，招募巨噬細胞進入炎癥部位，各種炎性因子促進巨噬細胞向M1型極化，當炎癥后期時，機體理化環(huán)境逐漸發(fā)生變化，誘導(dǎo)M1型macrophage轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型macrophage進而促進炎癥痊愈。周彥恒等[51,53]實驗發(fā)現(xiàn)M1與M2

3、型巨噬細胞的比率可以影響正畸牙齒的移動以及正畸牙齒移動過程中的牙根吸收。抑制M1型macrophage可以抑制牙齒的移動速率，而體內(nèi)注射M1型macrophage可以緩解這種抑制。由此可以發(fā)現(xiàn)，M1與M2型macrophage在正畸牙齒的移動過程中具有重要的作用。Gsk-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在Wnt和Rankl信號傳導(dǎo)通路中具有重要的調(diào)節(jié)作用，可以調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)、骨改建以及炎癥反應(yīng)。有實驗證明gsk-3β基因缺陷小鼠的股骨骨質(zhì)

4、明顯的增加；注射Licl的大鼠在上頜擴弓過程中骨質(zhì)增加更為明顯；抑制gsk-3β可以抑制正畸牙齒移動過程中的牙根吸收。而且在正畸牙齒移動過程中與gsk-3β以及巨噬細胞極化相關(guān)因子都發(fā)生明顯變化。
　　因此，我們提出假設(shè)，在牙齒進行正畸移動過程中g(shù)sk-3β對巨噬細胞極化具有重要作用。實驗分為三個部分：
　　1.小鼠牙齒正畸移動模型的制作
　　目的：探究建立小鼠正畸牙齒移動模型的可行性方法。
　　方法：選用雄性1

5、0周齡C57小鼠30只，隨機分為0、1、3、5、7d組。除0d組外，在每一只小鼠的上頜切牙與右側(cè)的第一磨牙之間安置正畸拉簧。加力過程中定期檢測拉簧的脫落狀況，計算拉簧的脫落率。各組分別在相應(yīng)時間處死，取材，固定后，掃描Micro CT觀察牙齒移動狀況。脫鈣后進行冰凍切片，然后用HE染色和免疫熒光染色觀察骨質(zhì)改建。
　　結(jié)果：Micro CT結(jié)果顯示：第一磨牙與第二磨牙之間顯現(xiàn)出明顯的縫隙；HE染色顯示牙根周圍的壓力區(qū)出現(xiàn)破骨細胞，

6、存在骨組織的重建；免疫熒光trap染色顯示壓力側(cè)存在破骨細胞，壓力側(cè)的牙周膜變窄。
　　結(jié)論：小鼠牙齒移動模型制作成功。為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　2.體內(nèi)探究正畸加力過程中g(shù)sk-3β對巨噬細胞極化的影響
　　目的：探究gsk-3β對正畸牙齒移動距離的影響以及加力過程中巨噬細胞的變化。
　　方法：分別選30只野生C57小鼠和20只gsk-3β基因敲除C57小鼠。野生C57小鼠和gsk-3β基因敲除C57小鼠各20

7、只，正畸加力3d，5d，7d，14d（每組5只）后處死，取加力側(cè)上頜骨固定后掃描Micro CT測量牙齒移動后第一磨牙與第二磨牙之間的距離，進行冰凍組織切片后，免疫熒光染色觀察破骨細胞，巨噬細胞和M1型巨噬細胞變化。野生型10只腹腔注射Licl（隔天100ng/ml）加力3d，7d處死后掃描MicroCT。
　　結(jié)果：gsk-3β基因敲除組與野生C57注射Licl組牙齒移動距離無統(tǒng)計學(xué)差異；與野生C57組同期結(jié)果相比，gsk-3β

8、基因敲除小鼠牙齒移動距離明顯降低，壓力側(cè)破骨細胞，巨噬細胞以及M1型巨噬細胞都減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：gsk-3β基因敲除小鼠與野生小鼠相比正畸牙齒移動距離減少，巨噬細胞以及M1型巨噬細胞數(shù)量也減少，提示gsk-3β可能通過影響巨噬細胞極化來影響正畸牙齒移動。間接驗證實驗假設(shè)。
　　3.體外驗證gsk-3β對巨噬細胞極化的影響
　　目的：體外驗證gsk-3β對巨噬細胞極化的影響。
　　方法：分別提取

9、gsk-3β基因敲除小鼠和野生型小鼠腹腔巨噬細胞（各3只），細胞爬片培養(yǎng)一周后免疫熒光染色觀察細胞陽性率；分別提取gsk-3β基因敲除小鼠和野生型C57小鼠腹腔macrophage（各3只），培養(yǎng)一周后，LPS（100ng/ml）誘導(dǎo)2d后，流式細胞檢測（標記iNOS） M1型巨噬細胞比例。
　　結(jié)果：巨噬細胞提取陽性率可達到90％以上；流式結(jié)果顯示誘導(dǎo)后gsk-3β基因敲除小鼠腹腔M1型macrophage的陽性率明顯低于野生型