費氏丙酸桿菌離位轉化維生素B12的工藝研究.pdf

1、費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）代謝合成維生素B12（Ado-cbl）的同時，會產生以丙酸為主的副產物，且丙酸對菌體生長具有一定的反饋抑制作用。發(fā)酵過程中如何降低丙酸的反饋抑制作用，提高費氏丙酸桿菌發(fā)酵的過程經濟性是一個至關重要的問題。為了實現費氏丙酸桿菌“邊分離、邊轉化、邊發(fā)酵”的半連續(xù)發(fā)酵生產，本研究提出采用細胞離位轉化的方式來進行維生素B12的合成，即當發(fā)酵進行到某個時間節(jié)點時，將菌

2、體細胞從發(fā)酵液中分離出來，轉移至另一個反應體系中，加入5,6-二甲基苯并咪唑（5,6-Dimethylbenzimida-zole, DMB）進行維生素B12的合成，從而在分批補料發(fā)酵的基礎上實現費氏丙酸桿菌的半連續(xù)發(fā)酵。本文首先通過研究代謝中間體脫氧腺苷咕啉醇酰胺（Ado-cbi）與產物維生素B12的關系考察了費氏丙酸桿菌細胞離位轉化合成維生素B12的可行性，并從細胞分離時機、分離方式、離位轉化體系等方面進行了優(yōu)化，為費氏丙酸桿菌的半

3、連續(xù)發(fā)酵雙產物耦合分離發(fā)酵工藝奠定了前提條件。
　　本研究主要內容包括：⑴優(yōu)化HPLC檢測方法，將洗脫條件改為0-30min，5-24％乙腈梯度洗脫。通過維生素B12轉化過程中添加DMB后中間體Ado-cbi與產物維生素B12的關系找到了中間體Ado-cbi的檢測峰。使用液-質聯用（HPLC-MS）質譜分析測定了檢測峰分子質量為1239.3，與中間體Ado-cbi的分子質量一致。由此可以同時而且實時檢測代謝中間Ado-cbi以及產

4、物維生素B12。⑵通過對DMB添加時機以及添加量的研究確定了費氏丙酸桿菌轉化維生素B12時DMB的最適添加時機為發(fā)酵84h，最適添加量為0.9mg/L。研究了發(fā)酵初添加DMB策略，DMB補加策略以及DMB連續(xù)添加策略，發(fā)現轉化初期DMB在一定濃度范圍內對轉化速率有一定影響，發(fā)酵初添加DMB會大大降低維生素B12的產量，在轉化時以直接添加足量（0.9mg/L）DMB的添加方式為最優(yōu)。⑶為建立費氏丙酸桿菌的半連續(xù)發(fā)酵雙產物耦合分離發(fā)酵工藝，