費氏丙酸桿菌維生素B-,12-生物合成基因的克隆和解析.pdf

1、維生素B<,12>是一種哺乳動物所必需的維生素，具有廣泛的生理學作用，但是哺乳動物自身卻不能合成，僅有某些特定的微生物才能合成維生素B<,12>如桿菌，沙門氏菌，丙酸菌和假單胞菌。目前，工業(yè)上主要利用脫氮假單胞菌和費氏丙酸桿菌進行維生素B<,12>的生產。由于費氏丙酸桿菌不產生任何毒素，被美國FDA認定為GRAS(Generlly reagard as safe)，其發(fā)酵過程能耗低，染菌概率小。因此，費氏丙酸桿菌在維生素B12的發(fā)酵生產

2、上占據(jù)了越來越重要的地位。為了詳盡代謝過程，闡明合成途徑，迄今為止，人們已經(jīng)獲得了大部分費氏丙酸桿菌維生素B<,12>生物合成相關的基因，但是，應用費氏丙酸桿菌發(fā)酵生產維生素B<,12>的生物合成途徑仍不明確。 本研究以費氏丙酸桿菌為出發(fā)菌株，克隆、解析了與維生素B<,12>生物合成相關的部分基因。首先，應用遺傳互補法，將費氏丙酸桿菌IFO12424株的染色體基因文庫，電擊轉化到Salmonella typhimurium Co

3、bⅢ領域的缺失突變株TT10858中，進行P.freudenreichi CobⅢ領域維生素B<,12>生物合成基因的篩選，結果得到了4206bp的DNA片段，命名為P4。解析結果表明，該片段包含了一個部分的和三個完整的讀寫框，依次為編碼L-蘇氨酸-O-3-磷酸鹽脫羧酶的cobD，編碼腺苷鉆啉酰胺(AdoCbi)激酶和AdoCbi-P鳥苷酸轉移酶的cobU，負責催化AdoCbi-GDP與α-ribazole連接，完成腺苷鈷胺素(AdoC

4、bI)最終合成的cobS，及編碼轉錄調節(jié)蛋白的cobR。 然后，根據(jù)所得cobD的堿基序列，設計相應引物，應用LA PCR<'TM> in vitro Cloning Kit，獲得了cobD上游3290bp的序列信息，命名為P3。經(jīng)序列分析，發(fā)現(xiàn)此片段包含了編碼鈷啉酸a，c-二酰胺合成酶的cbiA、負責傳遞腺苷將鈷啉胺酸a，c-二酰胺轉化生成腺苷鈷啉胺酸a，c-二酰胺的cobA，催化腺苷鈷啉胺酸a，c-二酰胺酰胺化生成腺苷鈷啉胺

5、酸的cbiP以及cobD的上游區(qū)域。 最后，將兩者合并后得到全長為7308bp的DNA片段，命名為P7。經(jīng)ORF檢索和同源性分析，發(fā)現(xiàn)此片段包含了一個部分ORF和5個完整的ORF，依次為cbiP，cobA，cbiA(cbiA-cobD)，cobU，cobS和cobR，它們編碼的蛋白負責催化費氏丙酸桿菌發(fā)酵生產維生素B<,12>過程中，從鈷啉胺酸a，c-二酰胺到最終AdoCbI的生成。因此，發(fā)現(xiàn)這些基因為探索費氏丙酸桿菌維生素B<