大腸桿菌LTB聯(lián)合EV71亞單位疫苗VP1鼻腔免疫效果評價.pdf

1、手足口病是由腸道病毒感染引起的，可以產(chǎn)生多種并發(fā)癥，嚴(yán)重者可致死。引發(fā)手足口病的腸道病毒以柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16，Cox A16)和腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)最為常見，VP1作為EV71的毒力蛋白具有極其重要的研究價值。VP1蛋白構(gòu)象發(fā)生變化導(dǎo)致病毒釋放RNA到宿主細(xì)胞，同時VP1蛋白也是病毒主要的表達(dá)抗原及中和表位。因此，VP1結(jié)構(gòu)蛋白成為了發(fā)展腸道病毒71型亞單位疫苗的候

2、選抗原。
　　耐熱腸毒素(heat-stable enterotoxin，ST)和不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin， LT)是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotox igenic Escherichia coli，ETEC)分泌的兩種毒性蛋白。LT的B亞單位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit,LTB)已被研究證實是有效的粘膜免疫佐劑，與其

3、它抗原聯(lián)合進(jìn)行粘膜免疫后可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和粘膜免疫應(yīng)答。
　　目的:構(gòu)建重組產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LTB基因的原核表達(dá)載體pET32a-LTB，檢測誘導(dǎo)表達(dá)的6×His-LTB融合蛋白的免疫原性，并探討EV71型VP1蛋白聯(lián)合純化LTB通過鼻腔粘膜免疫的效果。
　　方法:(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-LTB，轉(zhuǎn)化Escherichia coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。(2)表達(dá)的LTB融合蛋白帶有6

4、個His標(biāo)簽，可通過His標(biāo)簽瓊脂鎳柱純化，純化蛋白復(fù)性濃縮后經(jīng)新西蘭大白兔頸背部和后腳掌多點注射進(jìn)行皮下免疫，抗原每次免疫的劑量為300μg，一共免疫3次，免疫間隔時間為2周，末次免疫7d后，用注射器從兔心臟直接取血，血液自然凝固后離心分離血清，采用間接ELISA法檢測抗血清中IgG抗體效價。(3)分別用生理鹽水、EV71 VP1、LTB聯(lián)合EV71 VP1經(jīng)鼻腔免疫BALB/c小鼠，一共免疫三次，免疫間隔時間為一周，第三次免疫10d

5、后收集小鼠心臟血清、肺部沖洗液、小腸粘膜沖洗液，用間接ELISA法檢測血清中抗原特異性IgG和粘膜沖洗液中抗原特異性IgA。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)過質(zhì)粒雙酶切鑒定、半定量PCR、質(zhì)粒測序證實已成功構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-LTB。(2)6×His-LTB融合蛋白在BL21(DE3)中的主要存在形式為包涵體，表達(dá)的目的蛋白相對分子質(zhì)量（Mr）約為30 kD;300ml菌液純化的LTB蛋白復(fù)性濃縮至3ml后濃度為2.12 mg/

6、ml，ELISA檢測其免疫兔所得抗血清IgG效價為1∶125000。(3) EV71 VP1聯(lián)合LTB免疫組的血清特異性IgG，肺部沖洗液和小腸粘膜沖洗液中特異性IgA抗體水平相較于EV71 VP1單獨免疫組和生理鹽水對照組有明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:已成功在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)了6×His-LTB融合蛋白，純化的融合蛋白具有良好的免疫原性和佐劑活性。通過滴鼻免疫，LTB可有效誘導(dǎo)和增強(qiáng)EV71