miR-130b通過抑制CYLD表達維持NF-κB信號通路持續(xù)活化促進膀胱癌進展的機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在揭示miR-130b在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的角色，并且通過研究miR-130b在NF-κB信號通過活化中的作用，來進一步闡明膀胱癌中NF-κB信號持續(xù)活化的機制，進一步明確膀胱癌發(fā)展的分子基礎(chǔ)。同時，miR-130b作為NF-κB信號持續(xù)活化的中間調(diào)節(jié)因子，有潛力可能成為一個全新的治療靶點，并且作為評估膀胱癌預(yù)后的獨立因素。
　　方法：
　　一、實時定量PCR檢測膀胱尿路上皮癌細胞細以及臨床組織標本中

2、miR-130b的表達情況，以及miR-130b表達與膀胱癌臨床進展之間的相關(guān)性分析
　　我們檢測分析了正常尿路上皮細胞系SV以及六種不同膀胱尿路上皮癌細胞系中miR-130b的表達，以及30例正常癌旁和60例膀胱癌組織標本中miR-130b的表達水平。同時，我們分析了miR-130b表達水平與臨床資料之間的相關(guān)性。
　　二、通過CCK8增殖實驗、平板克隆實驗、細胞周期檢測以及裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測miR-130b對膀胱癌細胞

3、系增殖能力的影響，Transwel l實驗檢測miR-130b對膀胱癌細胞系侵襲和遷移能力的影響
　　我們通過CCK8增殖實驗、平板克隆實驗、細胞周期檢測以及裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測miR-130b對膀胱癌細胞系增殖能力的影響，并且通過Transwell實驗檢測了miR-130b對膀胱癌細胞系侵襲和遷移能力的影響
　　三、通過生物信息學軟件，分析miR-130b的啟動子區(qū)域，并且通過細胞實驗分析NF-κ B信號的活化與mi R-

4、130b表達之間的關(guān)系
　　我們通過生物信息學軟件PromoterScan、Jaspar、Promoter2.0和Chipbase，分析了miR-130b的啟動子區(qū)域，找到了潛在的NF-κB結(jié)合位點。并且通過細胞實驗，分析了NF-κB信號的活化與miR-130b表達之間的關(guān)系。
　　四、雙熒光素酶報告基因檢測和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗分析NF-κ B與miR-130b之間的結(jié)合關(guān)系
　　我們構(gòu)建了包含miR-130b啟動子

5、野生型和突變型的報告基因質(zhì)粒，并且通過雙熒光素酶報告基因檢測和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗，分析了NF-κB與miR-130b之間的結(jié)合關(guān)系。
　　五、通過生物信息學分析手段，預(yù)測miR-130b的下游靶基因，通過蛋白免疫印記、實時定量PCR和雙熒光素酶報告基因檢測分析miR-130b與CYLD之間的調(diào)控關(guān)系，并且進一步研究miR-130b影響NF-κ B活性的機制
　　我們通過生物信息學軟件TargetScan，分析了miR-13

6、0b的下游靶基因，找到了CYLD作為研究對象，并且通過免疫印記法、實時定量PCR和雙熒光素酶報告基因檢測，分析了miR-130b與CYLD之間的調(diào)控關(guān)系。并且，我們通過CYLD回補實驗，進一步分析了miR-130b對NF-κB活性影響的機制。
　　六、臨床組織標本中檢測NF-κ B，mi R-130b以及CYLD之間的表達相關(guān)性
　　我們檢測了10個膀胱癌臨床組織標本中，NF-κB，miR-130b以及CYLD的表達水平，并

7、且通過Spearman相關(guān)性分析，研究了三者之間的表達相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　一、miR-130b在膀胱尿路上皮癌細胞系及組織中高表達，并且其表達水平與膀胱尿路上皮癌臨床進展呈正相關(guān)性
　　我們檢測了miR-130b在六種BTCC細胞系及正常尿路上皮細胞系(SV-HUC-1)中，以及在30個癌旁正常膀胱黏膜組織及60個膀胱尿路上皮癌組織中的表達情況，我們發(fā)現(xiàn)miR-130b在BTCC組織/細胞系中的表達要明顯高于正常

8、組織/細胞系。我們也分析了60例膀胱癌患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)miR-130b的表達與病理分級以及腫瘤分期之間具有顯著的相關(guān)性。
　　二、miR-130b在體內(nèi)及體外能夠促進膀胱癌細胞系的增殖能力
　　我們對5637和T24這兩種細胞系分別轉(zhuǎn)染miR-130b agomir、antagomir以及各自的陰性對照RNA(Negative control，NC)。通過CCK8增殖實驗、平板克隆實驗，我們發(fā)現(xiàn)過表達miR-130b后，

9、細胞的增殖能力明顯提高，而敲除之后則下降。進一步我們使用流式細胞儀檢測了細胞周期，發(fā)現(xiàn)過表達miR-130b后細胞周期明顯向G2/M期進展，而敲除之后細胞周期阻滯在S期。我們通過裸鼠體內(nèi)成瘤實驗，證實了miR-130b在體內(nèi)也能夠促進膀胱癌細胞系的增殖能力。
　　三、miR-130b能夠促進膀胱癌細胞系的遷移和侵襲能力，并且能夠誘導(dǎo)膀胱癌細胞上皮細胞一間充質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　我們發(fā)現(xiàn)，在過表達miR-130b之后，細胞的侵襲能力和遷

10、移能力均明顯升高，而敲除之后則出現(xiàn)下降。我們進一步分析了膀胱癌細胞的上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化模型，我們檢測了三種EMT相關(guān)蛋白，分別是E-cadherin、N-cadherin以及Vimentin。我們發(fā)現(xiàn)，過表達miR-130b能夠提高N-cadherin及Vimentin的蛋白表達水平，并且降低了E-cadherin的表達;而敲除miR-130b則能夠得到相反的結(jié)果。
　　四、NF-κ B能夠促進m iR-130b的表達
　

11、　我們通過生物信息學分析軟件 PromoterScan,分析了miR-130b的啟動子區(qū)域。我們發(fā)現(xiàn)，在其啟動子區(qū)域存在多個潛在的NF-κB結(jié)合位點。接下類，我們使用TNF-α處理細胞/BAY11-7082預(yù)處理后再使用TNF-α處理細胞/轉(zhuǎn)染NF-κB過表達質(zhì)粒這三種方法處理細胞，并且檢測了NF-κB的活化情況和miR-130b的表達變化。我們發(fā)現(xiàn)，NF-κB促進了miR-130b的表達。
　　五、NF-κ B通過與miR-13

12、0b的啟動子結(jié)合直接調(diào)控其表達
　　我們構(gòu)建了包含miR-130b啟動子區(qū)域野生型以及突變型的pmirGLO報告基因質(zhì)粒。我們先將報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到5637細胞中，24小時后，使用TNF-α處理細胞，再24小時后，檢測細胞的相對熒光活性。我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了包含野生型miR-130b啟動子報告基因質(zhì)粒的細胞，相對于空白載體，其相對熒光活性明顯升高，而突變型則無明顯變化。下一步，我們針對這三個結(jié)合位點，設(shè)計了三組特異性引物，并且通過染色

13、質(zhì)免疫共沉淀實驗，將沉淀的DNA片段，通過這三組特異性引物進行PCR擴增。實驗結(jié)果顯示，相對于陰性對照(IgG)，沉淀DNA中，結(jié)合位點1和3的含量明顯被富集，而在使用TNF-α處理后，這兩個位點的含量能夠進一步升高。
　　六、miR-130b能夠通過直接與CYLD的3' UTR結(jié)合，來抑制CYLD的基因和蛋白表達
　　我們使用TargetScan軟件對miR-130b的下游靶基因進行了分析，發(fā)現(xiàn)CYLD的3'UTR與miR

14、-130b高度匹配，并且是保守的。我們通過雙熒光素酶報告基因檢測，發(fā)現(xiàn)miR-130b agomir能夠抑制轉(zhuǎn)染了含有野生型CYLD3'UTR報告基因質(zhì)粒的細胞的熒光活性，而對于突變型則沒有效果。我們分別對5637和T24細胞，轉(zhuǎn)染了miR-130b agomir、antagomir以及對應(yīng)的陰性對照，并通過免疫印記法，檢測CYLD和NF-κB的表達水平。我們發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了miR-130bagomir后，CYLD的基因和蛋白表達水平均下

15、降，而細胞核中NF-κB的表達水平則出現(xiàn)升高;轉(zhuǎn)染miR-130b antagomir則出現(xiàn)相反結(jié)果。
　　七、miR-130b是通過抑制CYLD的表達而促進了NF-κ B的活化
　　我們使用了pcDNA-CYLD質(zhì)粒來進行CYLD的回復(fù)，我們共轉(zhuǎn)染miR-130bagomir/pcDNA-Vector以敲除CYLD，共轉(zhuǎn)染miR-130b agomir/pcDNA-CYLD以實現(xiàn)對CYLD的回復(fù)。并且檢測了p-IKK、IK

16、K、IκB、CYLD以及NF-κB的蛋白表達情況。結(jié)果顯示，miR-130b agomir抑制了CYLD的表達，促進了IKK的磷酸化以及IκB的降解。而回復(fù)了CYLD之后，這些蛋白的變化也得到了回復(fù)。這說明了，miR-130b是通過抑制CYLD表達，促進了NF-κB的活化。
　　八、臨床組織標本中檢測NF-κ B、miR-130b以及CYLD的表達，以及相關(guān)性分析
　　我們在十個膀胱癌組織標本中，檢測了NF-κB、miR-1

17、30b以及CYLD的表達情況，并且對結(jié)果進行了Spearmen相關(guān)性分析。我們發(fā)現(xiàn)，NF-κB與miR-130b表達呈正相關(guān)，而miR-130b與CYLD表達呈負相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　miR-130b在膀胱癌中是一個促癌基因，它能夠促進膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且它的表達水平與膀胱癌的臨床進展具有一定的正相關(guān)性。NF-κB能夠通過與miR-130b啟動子直接結(jié)合，從而促進miR-130b的表達;而CYLD，一個N