棒曲霉素引起HEK-293細(xì)胞DNA損傷的溶酶體途徑.pdf

1、目的:
　　 棒曲霉素(Patulin，PAT)，又稱(chēng)為展青霉素，屬于真菌毒素類(lèi)，主要是曲霉屬、青霉屬、裸囊菌屬等真菌的次生代謝產(chǎn)物。棒曲霉素在1940年第一次被分離出來(lái)，經(jīng)過(guò)多年的研究，在近些年人們逐漸認(rèn)識(shí)到這種棒曲霉素是存在于蘋(píng)果和蘋(píng)果產(chǎn)品中的毒素，并成為全球廣泛關(guān)注的霉素。
　　 國(guó)際癌癥研究中心(InternationalAgencyforResearchonCancer,IARC)將PAT對(duì)人類(lèi)的致癌性列為第三

2、類(lèi)。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定了食品中棒曲霉素的最高限量為50μg/L，而目前歐盟已有更嚴(yán)格要求的趨勢(shì)，50μg/kg為棒曲霉素殘留限定量，對(duì)嬰幼兒食品內(nèi)含量限定為10μg/kg體重。
　　 棒曲霉素經(jīng)過(guò)毒理學(xué)試驗(yàn)證明其能使動(dòng)物畸變、突變和癌變。研究還表明PAT還有遺傳毒性和免疫毒性。有研究顯示PAT的遺傳毒性與細(xì)胞的氧化應(yīng)激有關(guān)。近期研究證明了DNA的損傷與溶酶體膜穩(wěn)定性改變也有關(guān)系。因此，我們研究了棒曲霉素引起的DNA損傷與

3、細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及溶酶體的關(guān)系，旨在探討PAT遺傳毒性的機(jī)制。
　　 本研究選用人胚腎HEK-293細(xì)胞，探討棒曲霉素的DNA損害作用可能機(jī)制，為進(jìn)一步評(píng)估PAT對(duì)人類(lèi)的健康危害提供實(shí)驗(yàn)資料。
　　 方法:
　　 以HEK-293細(xì)胞作為試驗(yàn)系統(tǒng)。通過(guò)MTT試驗(yàn)檢測(cè)PAT對(duì)HEK-293細(xì)胞毒性大小，通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷情況，評(píng)價(jià)PAT遺傳毒性。為探討其可能的遺傳毒性機(jī)制，用DC

4、FH法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，用吖啶橙(Acridineorange)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性;采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)和氯化銨(NH4CL)對(duì)溶酶體進(jìn)行保護(hù)干預(yù);分別采用NAC、NH4CL、抑胃肽(pepstatinA)干預(yù)PAT所致的DNA損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSSv11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 5-20μM的PAT作用于HEK-293細(xì)胞1h后，引起細(xì)胞DNA鏈斷裂，細(xì)胞形成彗星樣拖尾，其尾

5、長(zhǎng)、尾矩和尾百分含量與PAT呈劑量依賴(lài)關(guān)系;2.5-40μM的PAT作用于HEK-293細(xì)胞1h后引起細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性發(fā)生改變，80μM的PAT作用1h后引起ROS水平增加。用10mM的NH4CL、500mM的NAC預(yù)處理HEK-293細(xì)胞1h后，都明顯保護(hù)了細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性。分別用10mM的NH4CL、500mM的NAC和100μM的pepstatinA預(yù)處理HEK-293細(xì)胞1h后，PAT引起的DNA鏈斷裂幾乎完全被阻止。但

6、用30μM的地昔帕明預(yù)處理后，PAT引起的DNA鏈斷裂沒(méi)有得到明顯改善，可能與單獨(dú)地昔帕明引起了HKE-293細(xì)胞DNA損傷有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 棒曲霉素可致HEK-293細(xì)胞DNA鏈斷裂，其作用機(jī)制可能與溶酶體途徑有關(guān)，通過(guò)溶酶體膜穩(wěn)定性的破壞釋放一些溶酶體水解酶，從而導(dǎo)致DNA鏈斷裂。NAC是有效的抗氧化劑，能與NH4CL同時(shí)保護(hù)溶酶體膜的穩(wěn)定性，說(shuō)明可能ROS的產(chǎn)生是PAT本身的毒性導(dǎo)致的，并通過(guò)溶酶體途徑引