五味子質(zhì)量控制及血清藥化學(xué)研究.pdf

1、中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥現(xiàn)代化的核心和難點(diǎn)，目前沒有統(tǒng)一模式，傳統(tǒng)方法是成分分離后進(jìn)行活性測試或活性引導(dǎo)下追蹤分離，采用傳統(tǒng)方法確實(shí)闡明了一些中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，但該法所確定的成分是否是藥效的代表性成分有時有待商榷。首先，中藥是多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜體系，其藥效往往是多種成分在不同靶點(diǎn)整合的結(jié)果，化學(xué)分離使這種整合作用消失;其次，傳統(tǒng)的口服給藥形式?jīng)Q定了中藥中被吸收進(jìn)入體內(nèi)的物質(zhì)才能產(chǎn)生活性，而且進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用的可能是原形成分，也可能

2、是代謝產(chǎn)物。因此，有學(xué)者提出了基于“含藥血清”的研究策略，其指導(dǎo)思想是:中藥要在體內(nèi)產(chǎn)生效應(yīng)，其效應(yīng)成分應(yīng)在預(yù)期的時間里以有效的濃度到達(dá)靶器官或組織，且必須由用藥部位進(jìn)入血液循環(huán)，并以血液為介質(zhì)輸送到靶器官或組織，因而可以把給藥后的血清（即含藥血清）作為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究對象。雖然吸收進(jìn)入體內(nèi)的成分不全是有效成分，但是經(jīng)過胃腸道的處理，進(jìn)入體內(nèi)成分的種類和數(shù)目大大減少，這樣可以簡化中藥復(fù)雜體系，而且其確定的有效成分是體內(nèi)直接產(chǎn)生藥效

3、的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　基于“含藥血清”的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究策略包括“血清藥理學(xué)(SerumPharmacology)”和“血清藥物化學(xué)（Serum Pharmacochemistry）”研究?！把逅幚韺W(xué)”指將含藥血清作用于體外細(xì)胞模型進(jìn)行藥效評價;“血清藥物化學(xué)”指采用現(xiàn)代分析方法對含藥血清中的藥源性成分（包括體外原形成分和體內(nèi)代謝產(chǎn)物）進(jìn)行定性定量分析。兩者相結(jié)合研究可以基本闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　五味子（Schis

4、andra chinensis）是木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)，含有多種化學(xué)成分，具有多種藥理活性，其中聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素（又稱五味子類木脂素）是其主要化學(xué)成分，也是主要活性成分，目前已從五味子中分離到該類成分50個。五味子類木脂素具有確切的保肝作用，其活性與結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與體內(nèi)代謝過程有關(guān)，但對該類成分的構(gòu)效關(guān)系及在體內(nèi)真正發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)目前的研究并無定論。因此

5、，采用血清藥化學(xué)方法研究五味子類木脂素的體內(nèi)過程對闡明其保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及構(gòu)效關(guān)系具有重要意義。
　　有鑒于此，本課題在對五味子進(jìn)行質(zhì)量控制及提取工藝等研究的基礎(chǔ)上，采用血清藥化學(xué)方法及指紋圖譜技術(shù)、LC-MS等檢測手段，對大鼠灌胃給藥后體內(nèi)產(chǎn)生的原形五味子類木脂素成分及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定性定量研究。
　　論文分文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究兩大部分。
　　第一部分，文獻(xiàn)研究。引用文獻(xiàn)83篇，綜述了五味子化學(xué)成分及五味子類木

6、脂素血清藥化學(xué)研究進(jìn)展，在此基礎(chǔ)上簡要介紹了本課題的研究思路和方案設(shè)計(jì)。
　　第二部分，實(shí)驗(yàn)研究。包括以下內(nèi)容:
　　一、五味子質(zhì)量控制及木脂素類成分提取工藝研究
　　1、基于指紋圖譜與一測多評法相結(jié)合的五味子質(zhì)量評價方法研究
　　采用HPLC法測定了12批五味子樣品的指紋圖譜，建立了指紋圖譜共有模式，指紋圖譜標(biāo)定共有峰24個，通過對照品比對，指認(rèn)了其中6個木脂素類成分分別為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五

7、味子甲素、五味子乙素和五味子丙素。12批樣品指紋圖譜的相似度均大于等于0.991。以五味子醇甲為內(nèi)參物，建立了五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素與五味子醇甲的相對校正因子，一測多評法計(jì)算了各成分在12批樣品中的含量。同時采用外標(biāo)法測定了12批樣品中以上6個木脂素類成分的含量，比較了計(jì)算值與實(shí)測值的差異，以驗(yàn)證一測多評法的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，建立的相對校正因子重現(xiàn)性良好，采用校正因子計(jì)算的含量值與實(shí)測值之間無顯著差異

8、。
　　2、五味子及其種子、果皮中6種木脂素類成分的含量比較
　　采用HPLC法對五味子種子和果皮中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素等6種木脂素類成分進(jìn)行了含量測定和分析比較。結(jié)果表明，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素在種子中的含量占果皮和種子總含量的平均值分別為91.23％、87.49％、95.10％、90.76％、93.43％和90.54％。提示

9、五味子中木脂素類成分主要存在于種子中。
　　3、五味子種子中木脂素類成分提取工藝研究
　　以五味子總木脂素類和6種主要木脂素提取量加權(quán)作為指標(biāo)，以回流次數(shù)、回流時間、乙醇濃度和乙醇用量為考察因素，每個因素設(shè)3個水平，選用L9(34)正交表安排試驗(yàn)優(yōu)選了五味子種子中木脂素類成分提取工藝，方差分析結(jié)果表明，回流次數(shù)、回流時間對木脂素類成分提取率有顯著影響，乙醇濃度和乙醇無明顯影響，最終優(yōu)選的提取工藝為6倍量95％乙醇回流3次，每

10、次60min。
　　4、五味子種子提取物指紋圖譜研究及木脂素類成分含量測定
　　采用HPLC法測定11批五味子種子提取物的指紋圖譜，建立了指紋圖譜共有模式，11批樣品指紋圖譜標(biāo)定了共有峰24個，通過對照品比對，指認(rèn)了其中6個木脂素類成分分別為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素。11批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均＞0.994。采用與藥材含量測定相同的一測多評與外標(biāo)法相結(jié)合的方法，測定

11、了提取物中上述6種木脂素類成分的含量，并對兩種方法的測定結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，兩種方法的測定結(jié)果無顯著差異。
　　二、五味子種子提取物血清藥化學(xué)研究
　　1、五味子種子提取物含藥血清指紋圖譜研究
　　雄性SD大鼠一次性灌胃給予五味子種子提取物（折算成五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的劑量分別為29.44、8.45、7.76和14.2mg/100g）后6h采集血漿，采用與五味子指紋圖譜的相同的色譜條件測

12、定了10批含藥血漿HPLC指紋圖譜，建立了指紋圖譜共有模式，通過與空白血漿圖譜比較，標(biāo)定了10批含藥血漿中代表藥源性成分的共有峰16個，與提取物及對照品指紋圖譜比對發(fā)現(xiàn)，16個共有峰中體內(nèi)代謝產(chǎn)物9個，原形成分7個，其中4個原形成分分別被指認(rèn)為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素。
　　2、五味子提取物及其含藥血漿中木脂紊類成分的UPLC-ESI/MS分析
　　采用UPLC-ESI-MS對五味子種子提取物及其大鼠灌

13、胃給藥后的含藥血漿中的藥源性成分進(jìn)行定性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取物中含五味子類木脂素29個，通過對照品比對，其中的5個分別被鑒定為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素，參考相關(guān)文獻(xiàn)推測了其余24個的結(jié)構(gòu)。大鼠灌胃五味子種子提取物后，體內(nèi)產(chǎn)生了28個藥源性成分，其中原形成分17個，代謝產(chǎn)物11個，17個原形成分中4個被鑒定為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素，未檢測到五味子酯甲，參考相關(guān)文獻(xiàn)推測其余13個成分

14、分別為異五味子醇甲、戈米辛D、巴豆酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛H、戈米辛F、五味子酯乙、五味子酚、巴豆酰戈米辛P、Gomisin M1、表戈米辛O、戈米辛N、苯甲酰異戈米辛O和五味子丙素。參考相關(guān)文獻(xiàn)推測11個代謝產(chǎn)物中的10個分別為7，8-順二羥基-3-去甲基五味子醇甲、戈米辛H的異構(gòu)體、戈米辛P、7，8-順二羥基-2-去甲基五味子醇甲、戈米辛H、7，8-順二羥基五味子醇甲、戈米辛（戈米辛的異構(gòu)體）、Deangeloylgomisin B

15、、五味子醇甲（五味子醇乙或五味子甲素）的代謝物、五味子乙素的代謝物;還有一個有待鑒定。
　　3、五味子提取物中4種木脂素與其單體的藥代動力學(xué)初步比較
　　雄性SD大鼠，一次性灌胃給予五味子種子提取物、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素后15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h采取血漿，通過比較醇提物和單體成分的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)五味子醇甲和五味子醇乙的藥動行為可能受其他木