GSPE在I-R引起的急性腎損傷和慢性腎纖維化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、急性腎損傷（AKI）的發(fā)病率日益增加，部分患者通過治療后其癥狀消失，但腎臟卻是不完全修復(fù)，在多年后會(huì)進(jìn)展為慢性腎臟病（CKD）。據(jù)最新報(bào)道顯示，AKI患者日后進(jìn)展為慢性腎臟病的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)25.8％，發(fā)展至終末期腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)也有8.6%。在急性腎損傷至慢性腎纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥的級(jí)聯(lián)放大作用、成纖維細(xì)胞的活化增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)等均發(fā)揮了重要作用，如若能抑制其進(jìn)展過程中的這些反應(yīng)，將大大減少AKI患者發(fā)展至CKD的比例。葡萄籽原花青

2、素（GSPE）是從葡萄籽中提取出的多酚類化合物，具有極強(qiáng)的抗氧化、清除氧自由基、抗炎等作用。聯(lián)想到急性腎損傷和慢性腎纖維化均與炎癥有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)將GSPE應(yīng)用到小鼠急性腎損傷及慢性腎纖維化模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSPE不僅可以減輕AKI時(shí)的腎小管損傷、間質(zhì)炎癥，對(duì)慢性腎纖維化也有著一定的抑制作用。在腎臟損傷后激發(fā)炎癥的觸發(fā)蛋白中，我們發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白（HMGB1）的作用尤為重要，它是一種廣泛存在于有核細(xì)胞胞核上的高度保守的DNA結(jié)合蛋白，一

3、旦被釋放至胞外，即可啟動(dòng)免疫反應(yīng)，在腎臟，HMGB1既可由損傷壞死的腎小管上皮細(xì)胞被動(dòng)分泌，也可由浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞主動(dòng)分泌。在急性腎損傷后，GSPE抑制了HMGB1的胞漿核轉(zhuǎn)移，減少了其下游P65的活化，從而減輕了腎間質(zhì)炎癥，同時(shí)在慢性腎纖維化的進(jìn)展過程中，GSPE對(duì)HMGB1及其下游信號(hào)通路也有一定的抑制作用，但沒有急性腎損傷時(shí)明顯，因此我們考慮到 GSPE可能還從其他方面影響了腎間質(zhì)纖維化。成纖維細(xì)胞的活化增殖在慢性腎纖維化中亦起到了

4、不可忽略的作用，通過體外培養(yǎng)NRK-49F細(xì)胞系，給予TGF-β刺激以及GSPE干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，GSPE通過抑制TGF-β下游經(jīng)典的Smad和非經(jīng)典的JNK信號(hào)途徑而減少了NRK-49F細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)。綜上所述，GSPE可以通過抑制炎癥的爆發(fā)而減輕急性腎損傷，但卻可通過抑制炎癥和成纖維細(xì)胞活化來減輕慢性腎間質(zhì)纖維化。
　　第一部分 GSPE在急性腎損傷中的作用及其機(jī)制的研究
　　目的：探討GSPE在急性腎損傷模型中所起的作用

5、及其機(jī)制。
　　方法：將6周大小的C57BL/6雄性小鼠分為假手術(shù)組、單純給予GSPE組、雙側(cè)缺血再灌注（I/R）+PBS組、雙側(cè)I/R+不同濃度GSPE組等。通過灌胃在手術(shù)前連續(xù)給予小鼠PBS以及不同濃度的GSPE5天后，在37℃條件下，夾閉小鼠雙側(cè)腎臟30分鐘，24小時(shí)后提取小鼠血液及腎臟標(biāo)本。檢測(cè)小鼠血肌酐和尿素氮水平，用PAS和Tunnel染色以及 Kim-1的 RT-PCR來觀察腎臟損傷壞死情況，免疫熒光、免疫組化來檢測(cè)

6、F4/80、LY6G、MPO的浸潤(rùn)以及HMGB1的表達(dá)量和分布情況，RT-PCT檢測(cè)炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β以及趨化因子CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL5、ICAM-1等的表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)胞漿HMGB1、TLR4以及胞核P65表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組和單純給予GSPE組相比，雙側(cè)I/R+PBS組小鼠手術(shù)后血肌酐、尿素氮明顯增高，而雙側(cè)I/R+GSPE組小鼠其血肌酐

7、、尿素氮只有輕度上升，尤其是在給予小鼠250mg/kg濃度的GSPE時(shí)其上升幅度最小。同時(shí)與雙側(cè)I/R+PBS組小鼠相比，雙側(cè)I/R+GSPE組小鼠其腎小管損傷壞死的程度大大減輕，Kim-1和Tunnel陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)量明顯下降，間質(zhì)炎癥細(xì)胞—巨噬細(xì)胞（F4/80陽(yáng)性細(xì)胞）和中性粒細(xì)胞（LY6G陽(yáng)性細(xì)胞/MPO陽(yáng)性細(xì)胞）浸潤(rùn)減少，炎性因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）和趨化因子（CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL5

8、、ICAM-1）的表達(dá)也明顯減少。在假手術(shù)組和單純GSPE組，HMGB1主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞胞核上，極少有胞漿核轉(zhuǎn)移，其下游受體--TLR4和效應(yīng)蛋白--P65表達(dá)量極低，而在雙側(cè) I/R+PBS組HMGB1大量轉(zhuǎn)移至胞漿并釋放至胞外，并激活其下游 TLR4和P65，這一信號(hào)通路的活化在雙側(cè)I/R+GSPE組被明顯抑制。
　　結(jié)論：GSPE通過抑制HMGB1-TLR4-P65信號(hào)通路來減輕了急性腎損傷時(shí)的炎癥爆發(fā)，從而緩解了腎

9、小管的損傷。
　　第二部分 GSPE通過抑制腎間質(zhì)炎癥來減輕慢性腎纖維化
　　目的：探討GSPE在慢性腎纖維化模型中所起的作用及其抗炎機(jī)制。
　　方法：將6周大小的C57BL/6雄性小鼠分為假手術(shù)組、單純給予GSPE組、單側(cè)I/R+PBS組、單側(cè)I/R+250mg/kg GSPE組等4組。在37℃條件下，假手術(shù)組開腹30分鐘，手術(shù)小鼠夾閉左側(cè)腎臟30分鐘，右側(cè)腎臟不予處理，術(shù)后一天開始通過灌胃連續(xù)給予PBS和GSPE1

10、4天后，提取標(biāo)本。PAS染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化，Masson和天狼星紅染色觀察纖維化程度，免疫組化和 Western blot來檢測(cè) PDGFR-β、CollagenⅠ、Vimentin、α-SMA、HMGB1、胞漿 TLR4以及胞核 P65的表達(dá)變化，免疫熒光檢測(cè)F4/80和LY6G的表達(dá)及分布，RT-PCR檢測(cè)CCL2、IL-6、TNF-α、IL-1β的表達(dá)。
　　結(jié)果：假手術(shù)組和單純給予GSPE組Masson和天狼猩紅染色未

11、見膠原沉積，PDGFR-β、CollagenⅠ、Vimentin、α-SMA的表達(dá)量極少，但在單側(cè)I/R+PBS組，纖維化指標(biāo)都明顯上升，而這一上升變化在單側(cè)I/R+GSPE組均被明顯抑制。與纖維化變化趨勢(shì)一致的還有間質(zhì)炎癥反應(yīng)，GSPE干預(yù)后明顯減輕了炎癥細(xì)胞--巨噬細(xì)胞（F4/80陽(yáng)性細(xì)胞）和中性粒細(xì)胞（LY6G陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞）的浸潤(rùn)以及炎癥因子和趨化因子--CCL2、IL-6、TNF-α、IL-1β等的表達(dá)。與假手術(shù)組相比，單側(cè)

12、I/R+PBS組的HMGB1表達(dá)量升高，主要表達(dá)于腎間質(zhì)，其下游TLR4和P65表達(dá)也相應(yīng)增加，但這一變化在單側(cè)I/R+GSPE組有所減輕，但不如急性腎損傷時(shí)明顯。
　　結(jié)論： GSPE通過抑制HMGB1-TLR4-P65信號(hào)通路來減輕慢性腎纖維化進(jìn)程中的間質(zhì)炎癥，從而減輕了腎間質(zhì)纖維化。
　　第三部分 GSPE通過抑制成纖維細(xì)胞的活化來減輕腎纖維化
　　目的：通過體外實(shí)驗(yàn)研究GSPE對(duì)腎臟成纖維細(xì)胞活化的作用及其機(jī)制

13、。
　　方法：用10ng/ml TGF-β刺激NRK-49F細(xì)胞，并給予3種不同濃度GSPE干預(yù)，48h后提取標(biāo)本，Western blot、RT-PCR及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) Fibronectin、CollagenⅠ、α-SMA等纖維化指標(biāo)的變化。同樣用10ng/ml TGF-β刺激及GSPE干預(yù)細(xì)胞，于30分鐘時(shí)提取蛋白，用 Western blot檢測(cè) Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3、JNK、p-JNK等信號(hào)蛋

14、白的表達(dá)。
　　結(jié)果：與Control相比，用TGF-β刺激48h后的NRK-49F細(xì)胞中Fibronectin、CollagenⅠ、α-SMA的表達(dá)量明顯上升，但在給予GSPE干預(yù)后，這些纖維化蛋白表達(dá)降低，而且其降低程度與GSPE的濃度成正比。而于30分鐘提取的蛋白，其Smad2/3、JNK的表達(dá)量并無變化，但p-Smad2、p-Smad3、p-JNK等磷酸化蛋白在TGF-β刺激后表達(dá)明顯上升，但均可被GSPE抑制，且其抑制程