完全性葡萄胎遺傳易感基因及其對絨癌細胞生物學(xué)行為作用的研究.pdf

1、完全性葡萄胎（Complete hydatidiform mole， CHM）是一種具有惡變傾向的良性滋養(yǎng)細胞疾病。流行病學(xué)的數(shù)據(jù)顯示，完全性葡萄胎的種族或地域分布存在明顯差異，這提示其發(fā)病可能與親代的遺傳有關(guān)?，F(xiàn)階段的細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄胎是雄性基因表達過度導(dǎo)致的，完全性葡萄胎是單獨雄性基因表達的結(jié)果;雙親來源葡萄胎發(fā)病與母系印跡基因突變的關(guān)系已有所揭示，但迄今對非家族性復(fù)發(fā)性完全性葡萄胎（散發(fā)性葡萄胎）中母系基

2、因的缺失與母系遺傳背景的關(guān)系幾乎一無所知。
　　近幾年，測序技術(shù)的高速進展，讓在芯片的高通量技術(shù)上發(fā)展的測序技術(shù)，即二代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)應(yīng)時出世。芯片技術(shù)的形成成功地提升了發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的及個體相關(guān)的基因突變的水平。全外顯子組測序(wholeexome sequencing，WES)是憑借人類基因組中外顯子區(qū)的蛋白質(zhì)編碼序列(codingsequence)為目標的第二代測序技術(shù)

3、，存在于外顯子組(exome)的序列甚至都沒有人類整個基因組序列的1％，但在已有研究發(fā)現(xiàn)及文獻報道的人類的單基因遺傳病中，其中85％的致病突變位點是位于外顯子區(qū)域的。已有研究顯示，WES能發(fā)現(xiàn)個體家族性遺傳疾病和一些具有復(fù)雜性狀的遺傳病的低頻突變，提示利用該技術(shù)有助于篩查和發(fā)現(xiàn)葡萄胎發(fā)病相關(guān)的易感基因。
　　絨毛膜癌(簡稱絨癌，Choriocarcinoma)是一種來源于胚胎滋養(yǎng)細胞的高度惡性腫瘤，繼發(fā)于葡萄胎、流產(chǎn)或足月分娩。與

4、其它惡性腫瘤相比，不同的是它極易通過血道，在很早期便可轉(zhuǎn)移至全身，而其它腫瘤往往晚期才發(fā)生血運轉(zhuǎn)移。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，葡萄胎遺傳易感基因MIIP與這種惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤的早期轉(zhuǎn)移的行為關(guān)系迄今為止未被研究。
　　本研究應(yīng)用全外顯子測序?qū)︻净纪耆云咸烟ズ鸵延幸淮握Ｈ焉锏闹袊鴿h族婦女進行可能的易感基因突變篩查。再通過生物學(xué)信息分析后，獲得候選易感基因，同時進一步通過能精確檢測及驗證的單堿基延伸和激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜進行二次篩查。

5、最后將對候選易感基因，進行金標準Sanger測序的驗證。在此基礎(chǔ)上，通過查閱文獻，了解部分易感基因的功能，選擇對調(diào)控細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為MIIP基因，在絨癌細胞中進行體外基因功能實驗及機制探究。旨在了解完全性葡萄胎發(fā)病易感基因和及其對絨癌惡性生物學(xué)行為的作用。
　　第一部分通過全外顯子測序技術(shù)揭示完全性葡萄胎中ERC1及KCNG4突變的遺傳易感性
　　目的:
　　篩查母系遺傳背景在母系基因缺失的非家族性復(fù)發(fā)性

6、完全性葡萄胎中可能遺傳易感基因。
　　方法:
　　通過二代測序技術(shù)(NGS)方法中的全外顯子組測序技術(shù)(WES)，對51例非家族性復(fù)發(fā)性完全性葡萄胎患者及47例已分娩一次的正常孕婦的外周血DNA進行遺傳易感性的篩查。再通過單堿基延伸[Single base extension，SBE]和激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)[Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time ofFl

7、ight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS]在199例完全性葡萄胎患者和400例正常對照中進行二次篩查，最后將對候選易感基因，在247例完全性葡萄胎患者及599例正常對照女性（包含205例新增的對照樣本）中進行金標準Sanger測序的驗證。通過查閱當前文獻，推測易感基因與非家族性復(fù)發(fā)性完全性葡萄胎的可能形成機理。
　　結(jié)果:
　　1、在全外顯子篩查時，發(fā)現(xiàn)了398，594單核苷酸突變位點，其中罕見

8、的有害突變位點有5301個，罕見突變中包含了2，033個單位點突變基因和1，054個多位點突變基因
　　2、在Mass-ARRAY進行二次篩查后，發(fā)現(xiàn)有三個基因位點可能與散發(fā)性的完全性葡萄胎的發(fā)生有關(guān)，它們分別是ERC1中的c.G48C(p.Q16H)(p=0.01244)，KCNG4中的c.G1114A(p.G372S)(p=0.01156)和MIIP中的c.C739T(p.R247W)(p=0.023152)
　　3、進

9、行擴大樣本驗證后，ERC1中的c.G48C(p.Q16H)(p=0.0008361)，KCNG4中的c.G1114A(p.G372S)(p=0.017728)統(tǒng)計學(xué)意義仍然明顯。
　　結(jié)論:
　　1、ERC1的c.G48C(p.Q16H)位點和KCNG4的c.G1114A(p.G372S)位點，這兩個位點可能增加完全性葡萄胎的發(fā)生幾率(p＜0.05).
　　2、ERC1和KCNG4可能影響減數(shù)分裂時中心體的牽拉作用，進

10、而影響卵細胞的減數(shù)分裂過程
　　第二部分 MIIP基因?qū)q癌細胞生物學(xué)功能影響及可能的相關(guān)機制的研究
　　目的:
　　明確MIIP對絨毛膜癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及裸鼠荷瘤能力等生物學(xué)行為的調(diào)控作用及其可能的相關(guān)通路機制。
　　方法:
　　采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)法檢測MIIP在女性生殖器相關(guān)組織中的mRNA水平，及在絨癌細胞系

11、和正常滋養(yǎng)細胞模型的細胞系中的mRNA水平。利用Western-blot技術(shù)檢測蛋白水平的表達。利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分別在絨癌細胞株JAR和JEG-3中轉(zhuǎn)染MIIP慢病毒干擾序列或陰性對照下調(diào)MIIP的表達，在正常滋養(yǎng)細胞模型的細胞株SWAN中轉(zhuǎn)染MIIP表達質(zhì)粒上調(diào)MIIP的表達，分別通過CCK-8法檢測腫瘤細胞的增殖能力、流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡、傷口愈合實驗和Transwell聯(lián)合或不聯(lián)合matrigel實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力，

12、通過裸鼠荷瘤實驗檢測細胞的荷瘤能力。通過Western blot檢測MIIP在細胞內(nèi)可能基因的相關(guān)通路。
　　結(jié)果:
　　1.干擾MIIP的表達促進絨癌細胞株JAR和JEG-3細胞的增殖能力，促進細胞的遷移和侵襲能力，對細胞凋亡無明顯影響。
　　2、正常滋養(yǎng)細胞模型細胞株SWAN中上調(diào)MIIP的表達抑制細胞增殖，抑制細胞侵襲和遷移，對細胞凋亡無明顯影響。
　　3、低表達MIIP基因，對絨癌細胞株JAR細胞的荷瘤能