不同來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外生物學(xué)特性及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在造血干細(xì)胞移植中的應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增后的生物學(xué)特性及聯(lián)合造血干細(xì)胞移植治療血液病的研究 目的：體外擴(kuò)增源于人骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，鑒定其生物學(xué)特性，及探討其聯(lián)合造血干細(xì)胞移植治療血液病的可行性和安全性。 方法：體外擴(kuò)增來自16例健康供者及4例經(jīng)過化療的惡性血液病患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞。擴(kuò)增后的細(xì)胞經(jīng)免疫表型檢測(cè)、成骨和成脂肪誘導(dǎo)、染色體分析、衰老相關(guān)性β-半乳糖苷酶染色和與混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)一步鑒定其是否為臨床

2、所需的MSCs。體外擴(kuò)增后的MSCs聯(lián)合造血干細(xì)胞共移植治療血液病患者(自體移植5例、HLA全相合異基因移植15例、HLA半相合親緣供者非去T細(xì)胞移植2例)，觀察輸注反應(yīng)和移植后臨床特征。 結(jié)果：①從25.6士5.1ml骨髓(來自16例正常供者)樣本中成功擴(kuò)增得約(1.82士0.38)×106/kg(受者體重)MSCs，均體外培養(yǎng)3～4代。其免疫表型為CD73、CD90、CD105陽性，CD34、CD45，CD38、CD10、C

3、D20、CD33、HLA-DR陰性，純度達(dá)95％以上；具有成骨和成脂肪分化能力，可抑制MLRs中的淋巴細(xì)胞增殖，染色體核型正常，衰老相關(guān)性β-半乳糖苷酶染色絕大多數(shù)細(xì)胞呈陰性、少數(shù)呈弱陽性。②從4例化療后的惡性血液病患者(3例NHL，1例ANLL)骨髓中分離培養(yǎng)獲得的MSCs經(jīng)擴(kuò)增3～4代后獲得MSCs為(1.93士0.57)×106/kg。其各項(xiàng)生物學(xué)特征與正常供者骨髓來源的MSCs一致。③5例進(jìn)行自體外周血干細(xì)胞移植的惡性血液病患者

4、無論是輸注自體的MSCs(4例)還是異體的MSCs(1例，MSCs來自健康供者)，無輸注不良反應(yīng)。且患者均造血重建迅速，無嚴(yán)重并發(fā)癥，已隨訪45～70月。④12例HLA全相合同胞供者移植患者輸注來源于同一供者骨髓的MSCs無輸注不良反應(yīng).所有患者造血重建成功，移植后一月均呈100％供者型造血。2例(16.67％)出現(xiàn)Ⅱ～Ⅳ度aGVHD，2例(16.67％)出現(xiàn)廣泛性cGVHD。4例出現(xiàn)CMV感染，均治愈。有7例已隨訪29～57月，5例死

5、亡。⑤3例HLA半相合親緣供者非去T細(xì)胞移植患者輸注來源于同一供者骨髓的MSCs無輸注不良反應(yīng).所有患者造血重建成功，移植后一月均呈100％供者型造血。2例因預(yù)防或治療疾病復(fù)發(fā)予DLI后才發(fā)生Ⅳ度aGVHD和廣泛型cGVHD。另1例僅發(fā)生Ⅰ度急性GVHD和局限性慢性GVHD。2例現(xiàn)已分別隨訪了53月和43月，1例死亡。 結(jié)論：體外擴(kuò)增人骨髓中貼壁生長的細(xì)胞3～4代后經(jīng)免疫分型檢測(cè)和兩系分化誘導(dǎo)符合MSCs，且足夠數(shù)量、純度高、核

6、型正常、幾乎沒有老化，可應(yīng)用于臨床。在3種造血干細(xì)胞移植模式中，給患者輸注體外擴(kuò)增的BM-MSCs，均是安全可行的.要明確BM-MSCs輸注對(duì)于移植后造血重建、免疫重建、GVHD的影響，還需要更大樣本量和將患者分組統(tǒng)計(jì)分析。 第二部分真性紅細(xì)胞增多癥骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其功能特性的研究 目的：分離、培養(yǎng)真性紅細(xì)胞增多癥(PV)患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，并對(duì)MSCs的功能、特性進(jìn)行研究。 方法：采集

7、9例初診PV患者和6例正常個(gè)體的骨髓，應(yīng)用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲取MSCs，并傳代、擴(kuò)增。擴(kuò)增至第3代培養(yǎng)細(xì)胞，瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)，隔天消化細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線，電鏡檢測(cè)MSCs的超微結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs免疫表型和細(xì)胞周期，通過油紅O染色、Von Kossa染色檢測(cè)MSCs向脂肪、骨的分化，常規(guī)核型分析檢測(cè)MSCs染色體，等位基因特異性.聚合酶鏈反應(yīng)(AS-PCR)檢測(cè)其JAK2V617F點(diǎn)突變，RT-PCR檢測(cè)其

8、造血因子在mRNA水平的表達(dá)。 結(jié)果：PV和正常個(gè)體來源的MSCs均呈成纖維樣貼壁生長，細(xì)胞倍增時(shí)間約為43h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大部分細(xì)胞處于靜止期(>90％)，只有少部分細(xì)胞處于分裂期(<10％)。MSCs表達(dá)CD73、CD90，而CD34、CD45、CD133、HLA-DR均為陰性。MSCs在相應(yīng)的誘導(dǎo)條件下可以向骨、脂肪分化。PV來源的MSCs染色體檢測(cè)均為正常核型，其JAK2V617F點(diǎn)突變均為陰性。PV患者的MSCs表達(dá)

9、β2-μG、SCF、Flt3配體、TPO、LIF、IL-6、IL-11；不表達(dá)GM-CSF、G-CSF、IL-3，與正常人的一致。 結(jié)論：該細(xì)胞群體表現(xiàn)為正常人MSCs的生物學(xué)特性。 第三部分　大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中老化的研究 目的：MSCs因其多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能在再生醫(yī)學(xué)和臨床移植中被廣泛研究，需要在體外大量擴(kuò)增.已有人關(guān)注到人MSCs在體外擴(kuò)增的過程中會(huì)漸漸老化。關(guān)于大鼠MSCs在體外擴(kuò)增

10、過程中老化過程的研究未見報(bào)道。我們將大鼠骨髓MSCs在體外擴(kuò)增、傳代，觀察有無老化現(xiàn)象。 方法：全骨髓培養(yǎng)法接種大鼠骨髓細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，成骨和成脂肪培養(yǎng)鑒定。在傳代過程中，對(duì)每代細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。瑞氏染色觀察其形態(tài)，掃描電鏡測(cè)定其超微結(jié)構(gòu)，CCK-8試劑測(cè)定其生長曲線，成骨培養(yǎng)及VOS kossa染色，成脂肪培養(yǎng)及油紅O染色，以及衰老相關(guān)性β-半乳糖苷酶染色和P16ink4a基因定量測(cè)定。 結(jié)果：大鼠骨髓

11、單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)獲得的細(xì)胞呈梭型或多角型，有成脂肪和成骨分化能力。細(xì)胞瑞氏染色示細(xì)胞在傳代后漸趨肥大，相差顯微鏡顯示細(xì)胞傳代后漸趨扁平。超微結(jié)構(gòu)顯示2代細(xì)胞有20％有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張和少量線粒體髓鞘樣變；4代細(xì)胞均呈線粒體髓鞘樣變和空泡化。細(xì)胞在6代以前增殖旺盛，6代以后生長變緩，8～9代以后細(xì)胞幾乎不見生長.細(xì)胞衰老相關(guān)性β-半乳糖苷酶染色陽性率和P16ink4a基因表達(dá)量隨細(xì)胞傳代逐漸增加。成脂肪培養(yǎng)顯示細(xì)胞自6代以后成脂肪能力減