益氣化瘀方改善子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠內(nèi)膜容受性的實驗研究.pdf

1、目的：
　　建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，采用中藥復(fù)方“益氣化瘀方”進(jìn)行干預(yù)。從功能學(xué)角度觀察益氣化瘀方對模型大鼠妊娠功能的影響，從組織病理學(xué)和分子生物學(xué)角度觀察益氣化瘀方對模型大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響及對異位內(nèi)膜生長的影響。探討益氣化瘀方治療子宮內(nèi)膜異位癥同時改善子宮內(nèi)膜容受性，提高妊娠功能的作用機制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　通過手術(shù)切除大鼠右側(cè)子宮，剪取內(nèi)膜組織塊移植到腸系膜建立子宮內(nèi)膜異位癥

2、大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機分為益氣化瘀方組、孕三烯酮組、模型組，另設(shè)假手術(shù)組。各組給藥方法如下：益氣化瘀方組予益氣化瘀方混懸液（相當(dāng)于生藥3.55g/ml），按4ml/（Kg·d）連續(xù)灌胃6周；孕三烯酮組予孕三烯酮混懸液（0.1mg/ml），按4ml/（Kg·d）連續(xù)灌胃4周后以等體積滅菌蒸餾水連續(xù)灌胃2周；模型組及假手術(shù)組均予滅菌蒸餾水，按4ml/（Kg·d）連續(xù)灌胃6周。
　　實驗研究分為三個部分。第一部分實驗觀察益氣化瘀

3、方對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠妊娠功能的影響。在藥物干預(yù)結(jié)束后于動情期將雌雄大鼠以2:1比例合籠，以發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道脫落細(xì)胞涂片發(fā)現(xiàn)精子當(dāng)日記為妊娠第1天，于雌鼠妊娠第16天采集標(biāo)本。統(tǒng)計各組妊娠雌鼠數(shù)、妊娠雌鼠單側(cè)子宮著床數(shù)，電子天平稱量各胚胎及胎盤重量，平行切片法計數(shù)左側(cè)卵巢妊娠黃體數(shù)，計算大鼠妊娠率、著床率。第二部分實驗探討益氣化瘀方改善子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎著床的作用機制。在藥物干預(yù)結(jié)束后于動情期將雌雄大鼠以2:1比例合籠，于雌鼠妊

4、娠第4天采集標(biāo)本。ELISA法檢測大鼠血清雌二醇（E2）與孕酮（P）水平，免疫組化 SP法和蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測大鼠子宮內(nèi)膜雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、白血病抑制因子（LIF）、整合素αυβ3（αυβ3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)。第三部分實驗探討益氣化瘀方抑制異位內(nèi)膜生長的作用機制。用游標(biāo)卡尺測量大鼠干預(yù)前、后異位囊腫直徑，免疫組化SP法檢測大鼠異位內(nèi)膜ER、PR、αυβ3、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織

5、抑制物-1（TIMP-1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Casepase-9）表達(dá)。
　　免疫組化切片放大400倍，采用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析，測量特異蛋白表達(dá)陽性區(qū)域的累計光密度（IOD）值及區(qū)域面積（area），以平均光密度（IOD/area）代表蛋白表達(dá)強度，結(jié)果記錄為平均光密度值。
　　Western blot采用Bio-rad XRS+成像儀采集圖像，測定目標(biāo)條帶灰度值，選擇β-acti

6、n為蛋白內(nèi)參，結(jié)果記錄為目標(biāo)條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。
　　應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示。計量資料經(jīng)參數(shù)檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或秩和檢驗，兩兩組間比較采用LSD或Kruskal-Wallis檢驗，組內(nèi)差異采用配對樣本 t檢驗或 Wilcoxon Signed-Rank檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。設(shè)定檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05

7、即為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1.益氣化瘀方對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠妊娠功能的影響
　　模型組排卵數(shù)、著床數(shù)、著床率、胚胎重量及胎盤重量均低于假手術(shù)組，益氣化瘀方組排卵數(shù)、著床數(shù)、著床率、胚胎重量及胎盤重量均高于模型組和孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）；而孕三烯酮組排卵數(shù)、著床數(shù)、著床率、胚胎重量及胎盤重量與模型組差異無顯著性意義（P>0.05）。
　　2.益氣化瘀方對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠

8、圍著床期血清 E2、P水平的影響
　　益氣化瘀方組 E2水平高于模型組和孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）；而孕三烯酮組E2水平與模型組差異無顯著性意義（P>0.05）。模型組 P水平低于假手術(shù)組，益氣化瘀方組 P水平高于模型組和孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）；但孕三烯酮組P水平與模型組差異無顯著性意義（P>0.05）。
　　3.益氣化瘀方對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響
　　模型組

9、圍著床期子宮內(nèi)膜ER表達(dá)高于假手術(shù)組，益氣化瘀方組和孕三烯酮組ER表達(dá)均低于模型組，益氣化瘀方組ER表達(dá)高于孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）。模型組圍著床期子宮內(nèi)膜 PR表達(dá)高于假手術(shù)組，益氣化瘀方組和孕三烯酮組PR表達(dá)均低于模型組，益氣化瘀方組 PR表達(dá)低于孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）。模型組圍著床期子宮內(nèi)膜 LIF、αυβ3、MMP-9表達(dá)均低于假手術(shù)組，益氣化瘀方組LIF、αυβ3、MMP-9表達(dá)均高于

10、模型組，差異有顯著性意義（P<0.05）；但孕三烯酮組LIF、αυβ3、MMP-9表達(dá)與模型組差異無顯著性意義（P>0.05）。
　　4.益氣化瘀方對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位內(nèi)膜的影響
　　益氣化瘀方組和孕三烯酮組干預(yù)后異位囊腫直徑均較干預(yù)前減小，差異有顯著性意義（P<0.05）；模型組干預(yù)前后異位囊腫直徑比較差異無顯著性意義（P>0.05）。
　　益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內(nèi)膜ER、PR表達(dá)均低于模型組，差異有顯

11、著性意義（P<0.05）；而益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內(nèi)膜ER、PR表達(dá)差異均無顯著性意義（P>0.05）。益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內(nèi)膜αυβ3、MMP-9表達(dá)均低于模型組，而TIMP-1表達(dá)均高于模型組，差異有顯著性意義（P<0.05）；但益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內(nèi)膜αυβ3、MMP-9、TIMP-1表達(dá)均差異無顯著性意義（P>0.05）。益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內(nèi)膜 Casepase-9表達(dá)均高于模型組，差異有顯著性意

12、義（P<0.05）；但益氣化瘀方組和孕三烯酮組Casepase-9表達(dá)差異無顯著性意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠妊娠功能偏低，益氣化瘀方能有效提高其排卵數(shù)和著床率，并能促進(jìn)胚胎發(fā)育。
　　2.益氣化瘀方能有效提升子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠圍著床期P水平，降調(diào)子宮內(nèi)膜上PR表達(dá)，并能上調(diào)子宮內(nèi)膜中LIF、αυβ3、MMP-9的表達(dá)，提示其可通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎著床而改善子宮內(nèi)膜