金磁微粒為載體的乙肝病毒表面抗原免疫學檢測方法的建立.pdf

1、乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)所引起的世界范圍的傳染性疾病，其包膜蛋白乙肝表面抗原(Htepatitis B surface antigen，HBsAg)是感染HBV的重要標志。目前臨床檢測血清(漿)中HBsAg常用以酶標板為載體雙抗體夾心EUSA法。 磁分離酶聯(lián)免疫測定法(Magnetic affinity immunoassay，MAIA)是20世紀80年代出現(xiàn)的一種檢測方法。將

2、酶聯(lián)免疫檢測系統(tǒng)與磁性微粒分離系統(tǒng)相結合，具有高敏感性、高特異性、無污染、無毒性、操作簡便和樣品用量少等優(yōu)點。本研究以新型磁性復合微粒一金磁微粒(Fe<,3>O<,4>/Au微粒)為載體，建立了HBsAg檢測的磁分離酶聯(lián)免疫法。即將抗乙肝病毒表面抗原的單克隆抗體(Anti-HBsMcAb)包被于金磁微粒的表面，加入對照血清，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗乙肝病毒表面抗原多克隆抗體(Anti-HBs PcAb-HRP)， 37。C

3、孵育25 min，形成雙抗體夾心復合物，引入TMB底物后，復合物上的酶則催化底物顯色，最后通過酶標儀檢測顯色液的吸光度值來檢測HBsAg的濃度。通過標準HBsAg血清盤對該方法進行了驗證和比較。結果表明，磁分離酶聯(lián)免疫法的批內及批間相對標準偏差較小(1.20～7％)；乙肝病毒表面抗原adr，adw，ay三種亞型的最低檢出濃度分別為0.5 ng/mL，0.5 ng/mL及1.0 ng/mL，其靈敏度與目前商品化ELISA試劑盒的檢測結果相

4、當；用本法對203份血樣進行檢測，結果與商品化ELISA試劑盒的檢測結果完全一致。 化學發(fā)光免疫分析法(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)具有極高的靈敏度和較寬的線性范圍，將其引入到磁分離酶聯(lián)免疫系統(tǒng)中可進一步提高方法的靈敏度。因此本實驗引入I．uminol-H<,2>O<,2>-HRP發(fā)光體系，通過對碘苯酚(PIP)對化學發(fā)光增強，建立了檢測HBsAg的磁分離酶聯(lián)免疫化學發(fā)光法。通過條件優(yōu)化

5、，選擇HRP標記抗體的稀釋度為1：1000，溫育時間為25 min，以0.1 mol/L CBS緩沖液(pH 9.5)為化學發(fā)光緩沖介質，選擇魯米諾、過氧化氫及對碘苯酚的濃度分別為5×10<'-4>mol/L，1×10<'-3>mol/L和1×10<'-3>mol/L，建立了HBsAg的濃度與其相對發(fā)光光子數(shù)值之間的標準曲線，結果顯示，線性良好，R<'2>=0.996，線性范圍為4～1100 pg/mL，檢測限為8.6x10<'-4>n

6、g/mL，比目前商品化試劑盒(檢測限通常為0.5～1 ng/mL)的靈敏性提高了1000倍。在線性范圍內選取濃度為4×10<'-10>g/mL，的HBsAg標準品，重復測定11次，其測定值的相對標準偏差(RSD)為6.8％。以上的研究工作表明以金磁微粒為載體的HBsAg免疫學檢測方法具有靈敏度高，操作簡單、快速，結果可靠等優(yōu)點，與化學發(fā)光免疫分析法結合后還可實現(xiàn)對HBsAg的高靈敏度定量檢測，因而在血站篩查及臨床檢測領域有較好的應用前景