FoxA1靶基因結(jié)合區(qū)遺傳變異與乳腺癌易感性及預(yù)后的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、乳腺癌位居全球發(fā)展中國家女性惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率之首，遺傳因素在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用?！禢ature Genetics》雜志上有研究詳盡分析了近年來乳腺癌GWAS發(fā)現(xiàn)的所有遺傳變異及與之連鎖的遺傳變異，發(fā)現(xiàn)這些遺傳變異有相當(dāng)一部分富集于FoxA1和ERα轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點，提示影響FoxA1結(jié)合力的SNP很有可能通過改變ERα與靶基因的結(jié)合和相應(yīng)靶基因的表達(dá)，從而在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本論文采用生物信息學(xué)分析、以醫(yī)院為基礎(chǔ)的

2、兩階段病例對照關(guān)聯(lián)研究以及分子生物學(xué)功能實驗，對中國人群乳腺癌在FoxA1靶基因結(jié)合區(qū)域的遺傳風(fēng)險位點進(jìn)行了深入的探索。
　　第一部分首先對在歐美人群中發(fā)現(xiàn)的此區(qū)域風(fēng)險位點進(jìn)行驗證，研究影響FoxA1結(jié)合的功能性位點在中國人群乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，結(jié)果呈陰性，提示此位點對乳腺癌的易感性可能存在種族差異；于是接下來我們在全基因組范疇內(nèi)篩選FoxA1靶基因結(jié)合區(qū)域內(nèi)影響FoxA1結(jié)合力的潛在功能性遺傳變異，致力于找到此區(qū)域的中國人群

3、特異性風(fēng)險位點，并對陽性位點進(jìn)行了生物學(xué)功能驗證；第二部分研究了前一部分中證實影響FoxA1結(jié)合力的功能性遺傳變異與乳腺癌新輔助化療預(yù)后的關(guān)聯(lián)，以期對我國乳腺癌的個體化防治提供一定的思路和依據(jù)。
　　第一部分 FoxA1靶基因結(jié)合區(qū)遺傳變異與乳腺癌易感性的分子流行病學(xué)研究
　　目的：研究歐美人群中發(fā)現(xiàn)的影響FoxA1結(jié)合的功能性位點rs4442975在中國人群乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并在全基因組范疇內(nèi)篩選出FoxA1靶基因結(jié)

4、合區(qū)影響FoxA1結(jié)合力的潛在功能性遺傳變異，找到該區(qū)域真正與中國人群乳腺癌相關(guān)的功能性遺傳變異。
　　方法：1.采用基于醫(yī)院的病例-對照研究共納入1227例乳腺癌病例和1285例健康對照，來驗證rs4442975與中國人群乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)，均為中國漢族女性。使用TaqMan技術(shù)對血液DNA樣本進(jìn)行基因分型。采用非條件logistic回歸分析候選SNP與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)，并根據(jù)ER、PR、絕經(jīng)狀況、吸煙飲酒史進(jìn)行分層分析。

5、同時采集病例的疾病進(jìn)展資料，通過計算OR來評價候選SNP與傳統(tǒng)疾病發(fā)展指標(biāo)（腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期）的關(guān)聯(lián)。
　　2.通過整合ENCODE數(shù)據(jù)、Match軟件預(yù)測以及ANNOVAR功能注釋等生物信息學(xué)分析逐步篩選出全基因組范疇內(nèi)FoxA1靶基因結(jié)合區(qū)的潛在功能性遺傳變異；接著利用兩階段的大樣本病例-對照研究分析候選功能性SNP與中國人群乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)，合并階段共納入2164例乳腺癌病例與2382例健康對照；

6、最后通過一系列生物學(xué)功能實驗，包括比較siRNA敲降前后的雙熒光素酶報告基因活性的變化、凝膠電泳遷移率變動分析（EMSA）、組織樣本的表達(dá)數(shù)量性狀位點分析（e-QTL）以及TCGA數(shù)據(jù)分析等驗證顯著關(guān)聯(lián)位點的生物學(xué)功能。
　　結(jié)果：1.非條件logistic回歸分析沒有發(fā)現(xiàn)rs4442975與中國人群乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，加性模型OR=0.96，95％CI=0.81-1.15，P=0.678。雜合子模型、突變純合模型以及顯性模型均

7、沒有統(tǒng)計學(xué)意義。ER、PR、絕經(jīng)狀況和吸煙飲酒史的分層分析中也未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。在rs4442975與中國人群乳腺癌的疾病進(jìn)展關(guān)聯(lián)研究中也發(fā)現(xiàn)類似的陰性結(jié)果，加性模型：腫瘤大小OR=1.06，P=0.823；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OR=1.01，P=0.933；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移OR=0.68，P=0.154；TNM分期OR=0.95，P=0.765。其他各種模型也未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。
　　2.經(jīng)過系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，我們篩選出了4個具有潛在功能的候選遺傳

8、變異，并在第一階段的病例對照研究中得到一個陽性位點rs6506689在第二階段的獨立中國人群進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)rs6506689-T能夠增加中國人群乳腺癌的患病風(fēng)險，加性模型OR=1.18（95%CI=1.08-1.30，P=0.001）。分層分析還發(fā)現(xiàn)，與攜帶野生純合GG基因型的個體相比，攜帶TT基因型的ER陽性患者（OR=1.43，95%CI=1.13-1.79，P=0.002）比ER陰性患者（OR=1.33，95%CI=0.99-1

9、.78，P=0.057）乳腺癌風(fēng)險升高的可能性更為顯著。
　　3.EMSA結(jié)果顯示含rs6506689-T等位基因的片段可能與某轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力更強；兩個ER陽性的人乳腺癌細(xì)胞系Mcf-7和T47D的雙熒光素酶報告基因結(jié)果提示rs6506689-T具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，而對FoxA1進(jìn)行siRNA敲降以后，不同等位基因轉(zhuǎn)錄活性之間的差異消失；利用TCGA基因型數(shù)據(jù)和表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行順式e-QTL分析，并通過Hi-C數(shù)據(jù)庫查看其染色質(zhì)交

10、互作用情況，同時在60例中國人群乳腺癌患者的癌旁組織中進(jìn)行驗證，結(jié)果均顯示RAB31基因的表達(dá)與rs6506689的多態(tài)性顯著相關(guān)（P=0.010），攜帶TT風(fēng)險基因型的個體RAB31表達(dá)水平顯著高于GG基因型攜帶者；TCGA數(shù)據(jù)中相較于正常的癌旁組織，RAB31與FoxA1在癌組織中均高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。
　　結(jié)論：1.歐美人群的功能性易感位點rs4442975并不影響中國人群乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展，提示此

11、遺傳變異對乳腺癌的易感性可能存在種族差異。
　　2.結(jié)合生物信息學(xué)分析、兩階段病例-對照關(guān)聯(lián)研究、生物學(xué)功能實驗三個不同范疇的研究，發(fā)現(xiàn)了FoxA1靶基因結(jié)合區(qū)域的潛在功能性遺傳變異rs6506689，可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子FoxA1的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活性來調(diào)控促癌基因RAB31的表達(dá)，從而影響了中國人群乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險。
　　第二部分 影響FoxA1結(jié)合的遺傳變異與luminal A型乳腺癌新輔助化療療效的關(guān)聯(lián)研究
　　目的

12、：探討前一部分研究中出現(xiàn)的影響了FoxA1功能的遺傳變異與中國人群中l(wèi)uminal A型乳腺癌新輔助化療療效及預(yù)后的關(guān)聯(lián)，以期能為luminal A型乳腺癌的個體化治療提供可靠的療效與預(yù)后預(yù)測分子標(biāo)志物，從而指導(dǎo)luminal A型乳腺癌的合理治療，改善患者預(yù)后。
　　方法：以接受蒽環(huán)類（表柔比星）和紫杉類（多西他賽）聯(lián)合方案行新輔助化療的luminal A型乳腺癌病例作為研究對象，使用TaqMan技術(shù)完成候選遺傳變異的基因分型，

13、采用非條件logistic回歸分析對遺傳變異與新輔助化療療效及副反應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
　　結(jié)果：1.納入175例luminal A型乳腺癌并進(jìn)行ET方案新輔助化療的患者，非條件logistic回歸分析沒有發(fā)現(xiàn)與新輔助化療療效呈陽性關(guān)聯(lián)的位點，rs4442975加性模型OR為0.73（95％CI=0.27-1.94,P=0.527），rs6506689為0.80（95％CI=0.43-1.47,P=0.464）。
　　2.新輔助

14、化療毒副作用的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)rs4442975與骨髓抑制的毒性反應(yīng)相關(guān)，加性模型提示每增加一個突變等位基因G，發(fā)生骨髓抑制的風(fēng)險降低62%（OR=0.38,95％CI=0.18-0.69,P=0.003）。而rs6506689與骨髓抑制以及消化道毒性之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（加性模型分別為OR=0.89,95％CI=0.56-1.41,P=0.611和OR=0.92,95％CI=0.58-1.44,P=0.707）。
　　結(jié)論：影響F