斑馬魚免疫相關(guān)基因研究.pdf

1、作為一種模式生物，斑馬魚被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)及免疫學(xué)等領(lǐng)域的研究。本文通過(guò)建立金黃色葡萄球菌感染前后的斑馬魚淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)和探索斑馬魚基因打靶技術(shù)來(lái)研究斑馬魚的免疫。 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是臨床上一種常見(jiàn)的引起炎癥反應(yīng)的病原微生物，我們通過(guò)兩次腹腔注射感染斑馬魚，建立了S.aureus-斑馬魚感染模型，從而為研究S.aureus的致病機(jī)理和探索斑

2、馬魚免疫防御機(jī)制打下了基礎(chǔ)。用傳統(tǒng)的Ficoll-Paque Plus試劑，從斑馬魚全血中分離出高純度的淋巴細(xì)胞，應(yīng)用SMART<'TM> cDNA Library Construction技術(shù)，構(gòu)建以真核表達(dá)載體pcDNA3為基礎(chǔ)的cDNA表達(dá)文庫(kù)。對(duì)于正常的斑馬魚淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)(Drlym)已測(cè)得4261 ESTs序列并拼接成2742clusters，對(duì)于S.aureus感染的斑馬魚淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)(Drjflym)已

3、測(cè)得6988 ESTs序列并拼接成5334 clusters。通過(guò)對(duì)感染前后文庫(kù)中與免疫應(yīng)答或抗感染信號(hào)途徑有關(guān)的序列及與其它高等脊椎動(dòng)物(小鼠和人)比較表明，斑馬魚的免疫應(yīng)答和抗感染機(jī)制與小鼠及人有較高的保守性。比如在斑馬魚Driflym文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)IL-10受體、TNF及其受體和CD40等分子相應(yīng)高表達(dá)，顯示了在斑馬魚中也可能同樣存在完整的IL-10抗感染信號(hào)通路。另外，在Driflym中還發(fā)現(xiàn)了一系列CD分子的高表達(dá)，其中的一些還是

4、首次在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)，如CD2、CD9、CDl8、CD53、CD40及CD84等。通過(guò)對(duì)感染前后兩個(gè)文庫(kù)的比較表明，S.aureus有能力激活斑馬魚淋巴細(xì)胞的增殖、分化和啟動(dòng)一些相關(guān)基因的表達(dá)。 在對(duì)兩個(gè)cDNA文庫(kù)的ESTs序列分析中，分別發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的免疫型受體基因(Novel immune-type receptor，nitr)，分別命名為nitr13(Drlym)和nitr14(Driflym)。nitr13定位于斑馬魚

5、第22號(hào)染色體上，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，通過(guò)Blast對(duì)斑馬魚基因組的搜索及用Genscan對(duì)其基因組序列的分析結(jié)果表明，在nitr13的5’端上游還存在4個(gè)與nitr13的IGv結(jié)構(gòu)域(domain)高度同源的編碼IGv序列(V1、V2、V3和V4)，但其中的V4發(fā)生了琥珀(TAG)突變提前終止了。在nitr13的3’端下游也存在2個(gè)編碼IGv序列(V6和V7)。把這7個(gè)IGv序列建立系統(tǒng)發(fā)生樹，分析結(jié)果表明，它們來(lái)自同一個(gè)祖基

6、因的兩次復(fù)制。通過(guò)Southern雜交結(jié)果分析表明，nitr13在基因組里只有一個(gè)分子拷貝(copy)，Northern雜交結(jié)果表明在受檢測(cè)的各組織中都有表達(dá)，只是表達(dá)水平有差異，在鰓里有較高表達(dá)。同樣，nitr14通過(guò)與斑馬魚基因組的比對(duì)，被定位于第16號(hào)和第14號(hào)染色體上，具有4個(gè)分子拷貝，與Southern雜交結(jié)果一致。Northern雜交結(jié)果表明NITR14在斑馬魚鰓中表達(dá)水平最高，在腎、腸和脾臟中也有較高表達(dá)，在精巢和心臟中表

7、達(dá)水平較低，而在其他樣品組織中沒(méi)能檢測(cè)到表達(dá)，表明NITRl3和NITR14可能參與先天性免疫反應(yīng)。 另外，本文還探討了利用斑馬魚單胞期(1-cell)受精卵為直接基因打靶(Genetargeting)載體注射材料，再加上兩種熒光蛋白(EGFP／DsRFP)作為正負(fù)篩選標(biāo)記，探索出一種在斑馬魚中成功進(jìn)行基因打靶的技術(shù)方法?？紤]到可行性和基因研究背景等因素，我們選擇了用斑馬魚B-actin啟動(dòng)子序列置換斑馬魚生長(zhǎng)激素(Growth

8、 hormone，GH)啟動(dòng)子序列。為此構(gòu)建了兩個(gè)打靶載體pGHT1.7k和pGHT2.8k，并對(duì)它們分別顯微注射斑馬魚受精卵。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)雖然pGHT2.8k的陽(yáng)性率比pGHT1.7k稍高，但其致死率也較高。利用綠色熒光和紅色熒光蛋白作為篩選標(biāo)記，挑出只發(fā)綠色熒光的胚胎并養(yǎng)到成魚后使其與野生型斑馬魚雜交，從而篩選出綠色熒光標(biāo)記的F1代，大約有2.5％的P0代可以遺傳綠色熒光蛋白，再對(duì)F1代進(jìn)行Southern雜交進(jìn)一步鑒定。P0代不