PTP1B抑制劑通過激活DOCK180-Rac1通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng).pdf

1、研究背景:
　　內(nèi)皮細(xì)胞(EC)遷移在血管生物學(xué)中是一項(xiàng)基本的生理過程，在胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育、血管生成/新生、后天的損傷修復(fù)以及諸多疾病的病理過程中都扮演著重要的角色。促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移不僅對(duì)治療性血管新生非常重要，同時(shí)對(duì)加速血管損傷后的再內(nèi)皮化和制造有穩(wěn)定功能的人造血管也有至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能最重要的因子，在內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過程中有不可取代的作用。PTP1B是酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族的重要成

2、員，也是在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的PTP。PTP1B是VEGF信號(hào)通路中非常關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子。近期，多項(xiàng)研究表明抑制PTP1B可以增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2型受體(VEGR2)的信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管新生。然而，PTP1B的底物非常廣泛。目前，我們還不清楚除了通過影響VEGFR2信號(hào)通路，PTP1B抑制劑是否還能通過其他機(jī)制影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移功能。在本次研究中，我們證實(shí)了PTP1B抑制劑可不通過VEGFR2信號(hào)通路而直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞

3、的運(yùn)動(dòng)的假說。利用人內(nèi)皮細(xì)胞做研究對(duì)象，我們證實(shí)了PTP1B抑制劑可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、伸展和遷移，這些作用可以被小G蛋白R(shí)ac1的抑制劑阻斷，而RhoA的抑制劑則沒有明顯作用。PTP1B抑制劑顯著增加了p130Cas的磷酸化以及p130Cas，Crk和Dock180之間的結(jié)合作用。然而，PTP1B抑制劑處理后，黏著斑激酶(FAK)，Src，paxillin和Vav2的磷酸化水平卻沒有改變。對(duì)DOCK180進(jìn)行基因沉默后，PTP1B抑

4、制劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的影響消失，而對(duì)Vav2基因沉默后卻沒有上述現(xiàn)象。在VEGFR2抑制劑存在的情況下，PTP1B抑制劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的促進(jìn)和對(duì)p130Cas/DOCK180的激活作用依然存在。根據(jù)以上結(jié)果，我們認(rèn)為DOCK180通路的激活是PTP1B抑制劑影響內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的另一機(jī)制，這一機(jī)制并不以VEGFR2通路的激活為必要條件。因?yàn)樾难懿∪梭w內(nèi)VEGF/VEGFR的功能通常呈現(xiàn)受損狀態(tài)，因此對(duì)于這些病人來說，PTP1B抑制劑

5、可能作為一種新的治療藥物用于促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移功能。
　　研究目的:
　　1.研究PTP1B抑制劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)控作用。
　　2.明確PTP1B抑制劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的作用是否絕對(duì)依賴于VEGFR2信號(hào)通路的激活。
　　3.探索PTP1B抑制劑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.試劑
　　3-(3，5-二溴-4-羥基苯甲酰)-2-乙基-N-[4-（1，3-噻唑-2

6、-氨磺酰））苯基]-1-苯并呋喃-6-磺酰胺（PTP抑制劑22），Rhosin和NSC23766，PP2，and Ki8751均購(gòu)自Merck Millipore(Darmstadt，Germany)。TCS401購(gòu)買自Tocris Bioscience(Bristol, UK)。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng)
　　人臍靜脈內(nèi)皮(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)及端粒酶-永生化

7、人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Telomerase-immortalized HumanMicrovascular Endothelial，TIME)細(xì)胞均購(gòu)買自美國(guó)ATCC公司。以完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)，加入5％胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(100U/ml)及青鏈霉素（(100μg/ml)，于溫度37℃，CO2濃度5％的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到70％-90％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選擇3-6代的HUVECs用于試驗(yàn)。
　　3.Tran

8、swell細(xì)胞遷移試驗(yàn)
　　Transwell遷移試驗(yàn)采用Boyden小室法。將細(xì)胞消化后重懸于無血清培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)目。向上室中加入105個(gè)細(xì)胞，下室中添加終濃度為1％胎牛血清作為趨化因子。在細(xì)胞孵箱中孵育6小時(shí)，用冰甲醇固定遷移穿過膜的細(xì)胞，之后用結(jié)晶紫染色。顯微鏡下，每孔取5-10個(gè)高倍(400X)視野照相并計(jì)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，上下小室均加入藥物刺激和對(duì)照。
　　4.細(xì)胞黏附試驗(yàn)
　　以含有0

9、.1％DMSO和10μM PTP InhibitorⅩⅫ的無血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。1小時(shí)后，用胰酶消化細(xì)胞，離心后將細(xì)胞重懸于含有處理因子的培養(yǎng)基中，接種于24孔板。30分鐘后，用PBS沖洗，去除沒有貼壁的細(xì)胞。向24孔板中加入冰甲醇固定細(xì)胞，固定完成后用1％的結(jié)晶紫染色。高倍鏡下，每孔取5-10個(gè)隨機(jī)視野拍照，對(duì)黏附的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　5.細(xì)胞伸展試驗(yàn)
　　以含有0.1％DMSO或目的藥物的無血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)

10、處理1小時(shí)。之后將細(xì)胞種在Lab-Tek8孔腔室玻片上(8-well Lab-TekⅡchamber slides Thermo Scientific，Waltham, MA，USA)，加入與預(yù)處理相同的刺激，繼續(xù)孵育1小時(shí)。1小時(shí)后，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(購(gòu)自Cytoskeleton，Denver，CO，USA)和DAPI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共染色。染色完成后，在共聚焦顯微鏡(Model LSM710，Zeiss，

11、Jena，Germany)下進(jìn)行觀察和圖像采集。采用Image-Pro Plus6.0軟件(Media Cybernetics，Rockville，MD，USA)測(cè)量細(xì)胞的平均面積。每次試驗(yàn)均截取150-200個(gè)來自隨機(jī)視野內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。此外，為了對(duì)細(xì)胞的伸展活動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)，我們首先將TIME細(xì)胞以PTP1B抑制劑或0.1％DMSO的無血清培養(yǎng)基預(yù)處理1小時(shí)。之后將細(xì)胞消化，重懸于含有上述刺激的無血清培養(yǎng)基中。將細(xì)胞種在膠原Ⅰ

12、包被的6孔板中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為105/孔。靜置3分鐘使細(xì)胞沉降并輕微貼壁，之后將細(xì)胞置于裝有佳能數(shù)碼相機(jī)的相差光學(xué)顯微鏡(Olympus Lifescience，Tokyo，Japan)下錄像20分鐘。
　　6.細(xì)胞活性檢測(cè)
　　進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)時(shí)，先將細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)至約100％密度，藥物處理后，應(yīng)用CellTiter96 Aqueous kit試劑盒(購(gòu)自Promega，Madison，WI，USA)，按照其提供的方法

13、進(jìn)行檢測(cè)。
　　研究結(jié)果:
　　1.PTP1B抑制劑增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和伸展
　　PTP抑制劑22(PTPI22)是一種細(xì)胞通透性的選擇性PTP1B抑制劑。首先，我們采用不同濃度的PTPI22處理TIME細(xì)胞24或48小時(shí)，發(fā)現(xiàn)低于20μM的濃度對(duì)細(xì)胞是沒有毒性作用的。接下來的實(shí)驗(yàn)，我們選用10μM的濃度作為試驗(yàn)濃度。PTPI22刺激TIME細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)TIME細(xì)胞在膠原Ⅰ包被界面的黏附和伸展運(yùn)動(dòng)顯著增強(qiáng)。為了連續(xù)觀

14、察細(xì)胞的伸展運(yùn)動(dòng)，我們?cè)陲@微鏡下對(duì)PTPI22處理組和對(duì)照組細(xì)胞伸展運(yùn)動(dòng)進(jìn)行錄像，結(jié)果顯示PTPI22顯著加快了TIME細(xì)胞的伸展運(yùn)動(dòng)。為了進(jìn)一步確認(rèn)PTPI22的作用，我們用HUVECs重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，證實(shí)PTPI22同樣也促進(jìn)了HUVECs的黏附和伸展。我們?cè)跊]有膠原包被的界面上重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PTPI22依然可以促進(jìn)細(xì)胞的伸展和黏附。此外，我們還選取了另一種PTP1B抑制劑TCS401重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，得到了相似的結(jié)果。
　

15、　2.PTP1B抑制劑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移
　　我們采用PTPI22和TCS401處理細(xì)胞后，以血清為趨化因子，采用Boydenchambers法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。結(jié)果證實(shí)，兩種藥物都可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。
　　3.抑制VEGFR2后PTP1B抑制劑的作用依然存在
　　用VEGFR2抑制劑Ki8751(2 nM)預(yù)處理細(xì)胞后，VEGF誘導(dǎo)的Erk1/2水平明顯下降，提示Ki8751有效的阻斷了VEGF/VEGFR2通路。

16、Ki8751預(yù)處理明顯抑制了TIME細(xì)胞的伸展反應(yīng)，但加入PTPI22后，TIME細(xì)胞的伸展反應(yīng)仍然增強(qiáng)。說明PTPI22在VEGFR2信號(hào)通路阻斷的情況下依然能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。為了進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論，我們進(jìn)行Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn)。結(jié)果顯示，Ki8751可以明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，但PTPI22處理后內(nèi)皮細(xì)胞的遷移依然增強(qiáng)。
　　4.PTP1B抑制劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的作用是Rac1依賴的
　　Rac1抑制劑

17、NSC23766(100μM)處理細(xì)胞后，顯著降低了內(nèi)皮細(xì)胞的伸展面積。同時(shí)，Rac1抑制劑能夠消除PTPI22對(duì)細(xì)胞伸展的促進(jìn)作用。PTPI22處理TIME細(xì)胞后，Rac1活性顯著增強(qiáng)。同時(shí)，Ki8751處理阻斷VEGF/VEGFR2通路后，PTPI22依然可以增強(qiáng)Rac1的活性。然而，應(yīng)用另一小G蛋白R(shí)ho的抑制劑Rhosin處理細(xì)胞后，卻不能消除PTPI22對(duì)細(xì)胞伸展的促進(jìn)作用。此外，遷移試驗(yàn)結(jié)果顯示NSC23766可以消除PTP