核糖核酸酶抑制因子定點(diǎn)突變的研究.pdf

1、該文用寡核甘酸介導(dǎo)的方法對RI基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,以期用基因工程的方法獲得穩(wěn)定性好,活性高的核糖核酸酶抑制因子.為此作了以下工作:第一種突變方法:設(shè)計合成5'端加入HindⅢ識別位點(diǎn)的引物PB,5'端加入NdeⅠ識別位點(diǎn)的引物PC和一個突變引物PA.采用PA和PB為引物,獲得點(diǎn)突變小片段.突變小片段以pET23b-ri為模板延伸后,再以其混合物為模板,以PB、PC為引物,獲得突變大片段.將突變大片段和用HindⅢ/NdeⅠ雙酶切后亞克隆于

2、pUC19載體.然后,將其轉(zhuǎn)化于DH5α菌.篩選獲得陽性克隆.用EcoNI/StuⅠ雙酶切pUC19-ri,取小片段取代pET23b-ri上的相應(yīng)片段.將重構(gòu)的pET23b-ri轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α,篩選陽性克隆.第二種方法突變:用突變引物PA和引物PB經(jīng)過PCR反應(yīng)得突變片段A;用突變引物P2和引物P1獲得突變片段B.兩片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶HhaⅠ消化后連接得突變大片段.突變大片段經(jīng)PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物EcoNI/StuⅠ雙酶切后重構(gòu)

3、于pET23b-ri.轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選獲得陽性克隆.經(jīng)雙脫氧末端終止法對突變的RI測序,結(jié)果目的基因如預(yù)期發(fā)生突變.將測序正確的陽性重組質(zhì)粒pET23b-ri轉(zhuǎn)化入腸桿菌表達(dá)菌BL21中.篩選鑒定陽性克隆.加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果.該文成功的突變了RI基因,將Cys329突變成Ala,并將其重構(gòu)于pET23b載體.重組突變基因轉(zhuǎn)化克隆菌DH5α后,又將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3),并進(jìn)行了初