血細胞核糖核酸酶抑制因子基因突變分析的方法建立及對宮頸癌患者的檢測.pdf

1、本實驗首先采用聚合酶鏈反應(PCR)的方法用正常對照組的血液標本提取出的基因組DNA為模板，進行實驗條件的優(yōu)化，其次將正常對照組與宮頸癌患者組血液標本提取出的基因組DNA為模板，分別擴增出以上21對引物所對應的目的片段。 為了驗證PCR擴增的效果，內(nèi)參采用β-actin。突變分析則利用單鏈構象多態(tài)性分析(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)的方法，亦使用正常對照組的PCR擴增產(chǎn)物來

2、進行實驗條件的摸索，根據(jù)PCR所擴增出的目的片段熱變性后在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的單鏈遷移率的差異來判斷突變是否發(fā)生。本實驗對PCR的實驗條件進行優(yōu)化后，設計的21對引物所對應的目的片段全部擴出。實驗在PCR擴增后將目的片段用于普通瓊脂糖凝膠電泳時，將正常對照組和宮頸癌患者組都擴增出的相應片段按照引物的不同分成21組進行比較，均未發(fā)現(xiàn)DNA條帶在遷移率上有差異。在經(jīng)過SSCP分析實驗的條件摸索后認為本實驗理想的實驗條件是：聚丙烯酰胺凝膠的

3、交聯(lián)度(丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺)49：1，濃度4﹪不加甘油，厚度1mm，電壓200v，溫度4℃，緩沖液0.5×TBE，上樣量5μl。SSCP分析的分組與以上普通瓊脂糖凝膠電泳的分組相同，根據(jù)公式M=Ld/Vt計算遷移率，使用統(tǒng)計學的三因素方差分析檢驗證明實驗重復性良好。聚丙烯酰胺凝膠電泳結果亦未顯示在正常對照組與宮頸癌患者組的DNA單鏈遷移率上有差異。 本實驗的結果顯示宮頸癌患者的核糖核酸酶抑制因子基因與正常人的核糖核酸酶抑制