膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)重建高位頸髓損傷后呼吸功能的研究.pdf

1、目的：
　　 一、為膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)重建高位頸髓損傷患者呼吸功能提供人體解剖依據(jù)
　　 二、采用免疫組織化學(xué)方法研究人體膈神經(jīng)及迷走神經(jīng)各段的運(yùn)動(dòng)纖維數(shù)量。
　　 三、尋找膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)的最佳位置，及最佳手術(shù)入路。
　　 四、建立膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)重建高位頸髓損傷大鼠呼吸功能的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 五、監(jiān)測膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)后大鼠頸髓橫斷前后的血?dú)夥治鲎兓?br>　　 六、利

2、用B型超聲監(jiān)測膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)后高位頸髓損傷大鼠膈肌活動(dòng)度的變化
　　 七、探討膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)后高位頸髓損傷大鼠膈肌肌電圖的變化特點(diǎn)。
　　 八、利用辣根過氧化物酶示蹤技術(shù)探尋膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)后高位頸髓損傷大鼠膈神經(jīng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的聯(lián)系。
　　 通過本實(shí)驗(yàn)探討膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)重建高位頸髓損傷大鼠呼吸功能的可行性。為臨床重建高位頸髓損傷患者的呼吸功能探討新方法，提供理論指導(dǎo)。
　　

3、 方法：
　　 一、選取20具（38側(cè)，2側(cè)標(biāo)本損壞）福爾馬林固定的成人標(biāo)本，解剖并觀察迷走神經(jīng)、膈神經(jīng)的走形特點(diǎn)，測量迷走頸部及胸部的神經(jīng)、膈神經(jīng)的長度、寬度及厚度，及其相互關(guān)系。
　　 二、選取膈神經(jīng)及迷走神經(jīng)神經(jīng)各特定位置的標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法對迷走神經(jīng)與膈神經(jīng)染色，進(jìn)行神經(jīng)纖維形態(tài)學(xué)觀察，并對膽堿乙酰移換酶單克隆抗體（choline acetylase, CHAT）以

4、及神經(jīng)纖維單克隆抗體（Neurofilament）陽性表達(dá)的神經(jīng)纖維應(yīng)用PV-9000病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。
　　 三、動(dòng)物模型建立：
　　 每組實(shí)驗(yàn)選取健康雄性SD大鼠15只（購于中科院上海研究所），體重180～200g。隨機(jī)分為A、B、C三組，每組5只。A組為膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)組，B組為膈神經(jīng)原位吻合組，C組為空白對照組。將A組5只大鼠腹腔麻醉后，鈍性分離迷走神經(jīng)及膈神經(jīng)干。將存在副膈神經(jīng)的大鼠剔除，于頸

5、6水平游離膈神經(jīng)，銳性切斷。將膈神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)斷端用11-0醫(yī)用無損傷針線端側(cè)吻合至迷走神經(jīng)。同法進(jìn)行對側(cè)手術(shù)。將B組大鼠腹腔麻醉后，暴露膈神經(jīng)干，將存在副膈神經(jīng)的大鼠剔除，于頸6水平游離
　　 膈神經(jīng)，銳性切斷。然后用11-0醫(yī)用無損傷針線將離斷膈神經(jīng)重新吻合。同法進(jìn)行對側(cè)手術(shù)。將C組大鼠應(yīng)行腹腔麻醉后，仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)。10％硫化鈉脫毛，消毒手術(shù)野后鋪巾。取鎖骨下切口暴露膈神經(jīng)，不行任何操作，撒青霉素粉劑后關(guān)閉手術(shù)切口，術(shù)后

6、不作任何外固定，任其自由活動(dòng)。進(jìn)行脊髓橫斷實(shí)驗(yàn)時(shí)，將上訴大鼠飼養(yǎng)10個(gè)月后，于C3/4水平橫斷脊髓。進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測量。
　　 四、術(shù)后10個(gè)月，將A、B各組大鼠麻醉后，仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。暴露膈肌及雙側(cè)迷走神經(jīng)吻合段。用雙極電極作為刺激電極置于神經(jīng)吻合口的近、遠(yuǎn)端2mm處進(jìn)行刺激，同芯針電極為記錄電極，插入膈肌的五個(gè)不同測量部位，對膈神經(jīng)對膈肌的重新支配情況進(jìn)行全面的評估。分別記錄波幅及傳導(dǎo)速度，信號經(jīng)放大后打印記錄以備后

7、續(xù)分析。將五只大鼠的5個(gè)位置的神經(jīng)傳導(dǎo)速度、潛伏期及波幅的平均值作為測量結(jié)果。C組大鼠選擇與B組吻合口相同的位置作為刺激電極置入的位置，記錄電極的位置與A、B組相同。同種方法測量對側(cè)。完成上述測量后，將A、B、C三組大鼠取頸后正中切口，切除頸3全椎板并于頸3、4水平銳性橫斷脊髓。同法測量三組大鼠波幅及神經(jīng)傳導(dǎo)速度的變化，與頸髓橫斷前測量結(jié)果相對比。
　　 五、飼養(yǎng)10個(gè)月后，分別將A、B、C各組大鼠行腹腔麻醉，仰臥位固定于動(dòng)物手

8、術(shù)臺(tái)。取腹正中切口，顯露腹主動(dòng)脈，順血流方向插入肝素化的特制軟硅膠管，分別抽取動(dòng)脈血各0.2ml，進(jìn)行pH值、氧分壓(Po2)、二氧化碳分壓(Pco2)及血氧飽和度(SO2)的監(jiān)測。然后取頸后正中切口，切除頸3全椎板并于頸3水平銳性橫斷脊髓。在頸3、4脊髓橫斷后1h、2h、3h、4h抽取動(dòng)脈血進(jìn)行pH值、氧分壓(Po2)、二氧化碳分壓(Pco2)及血氧飽和度(SO2)的監(jiān)測。同時(shí)監(jiān)測C組正常大鼠作為對照組，分析膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)后后

9、高位頸髓損傷大鼠血?dú)夥治鲋笜?biāo)的變化特點(diǎn)，以及正常值維持時(shí)間。
　　 六、術(shù)后10個(gè)月，將A、B、C三組大鼠腹腔麻醉后，將大鼠四肢向兩側(cè)牽引仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)。我們選擇1、劍突下；2、肋前；3、肋中三點(diǎn)應(yīng)用B型超生尋找膈肌，錄制三個(gè)周期的平靜呼吸下膈肌動(dòng)態(tài)圖，將其超慢回放，分別尋找膈肌平靜呼吸下呼氣末及吸氣末位置，兩者距離即為此位置下的膈肌動(dòng)度。每只大鼠的每個(gè)位置按上述方法測量5次，取每次的平均值為改點(diǎn)的膈肌運(yùn)動(dòng)幅度，再將三點(diǎn)

10、的測量值取平均值作為該大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)度的最后值I。將C組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度的變化IC設(shè)定為正常大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度。
　　 A組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度恢復(fù)率（IA/IC）=A組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度值IA/C組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度值IC；
　　 B組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度恢復(fù)率（IB/IC）=B組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度值IB/C組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度值IC；
　　 完成上訴實(shí)驗(yàn)測量后，將A、B大鼠于頸3水平銳性橫斷脊髓。30分鐘后按照前述方法重新測量膈

11、肌的運(yùn)動(dòng)幅度變化。設(shè)定頸3脊髓橫斷后大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)度的最后值為V。
　　 仍將C組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度的變化IC設(shè)定為正常大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度。
　　 頸髓橫斷后A組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度恢復(fù)率（VA/IC）=A組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度值VA/C組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度值IC；
　　 頸髓橫斷后B組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度回復(fù)率（VB/IC）=B組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度值VB/C組大鼠膈肌運(yùn)動(dòng)幅度值IC；
　　 七、術(shù)后10個(gè)月，將A組大鼠腹腔麻

12、醉后，顯露雙側(cè)膈神經(jīng)干及神經(jīng)吻合口。在膈神經(jīng)干上距吻合口1cm處，沿神經(jīng)纖維走行方向用微量注射器將1％CB—HRP 注入膈神經(jīng)干內(nèi)，然后灌注、固定、取材、制片、染色。觀察疑核內(nèi)是否染色。
　　 結(jié)果：
　　 一、頸部迷走神經(jīng)與膈神經(jīng)較易顯露且位置較近，容易吻合。胸部迷走神經(jīng)暴露相對較難，但由于其分支較多，選取其中一支與膈神經(jīng)移接對迷走神經(jīng)功能無影響，且能大大減少神經(jīng)纖維再生距離。在頸部，迷走神經(jīng)神經(jīng)纖維的總體數(shù)量遠(yuǎn)大于膈

13、神經(jīng)，且隨著向胸腔的延伸數(shù)量逐漸增加。迷走神經(jīng)內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維數(shù)量只占神經(jīng)纖維重量的1/3左右，但與膈神經(jīng)內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維數(shù)量接近。而在胸部迷走神經(jīng)與膈神經(jīng)神經(jīng)纖維總量相近，運(yùn)動(dòng)纖維數(shù)量為膈神經(jīng)的1/3左右。
　　 二、頸髓橫斷前A組與B組的神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)率、潛伏期及波幅恢復(fù)率與C組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P﹤0.05）。A組與B組的波幅恢復(fù)率較神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)率高。頸髓橫斷后B、C兩組大鼠迅速死亡，無法測量。A組大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度及

14、潛伏期與頸髓橫斷前無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但頸髓橫斷后A組大鼠波幅較頸髓橫斷前有明顯升高接近正常對照組。
　　 三、A、B、C三組的各項(xiàng)指標(biāo)基本接近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。頸3脊髓橫斷后B組大鼠全部死亡，A組大鼠頸3脊髓橫斷2小時(shí)后血?dú)夥治鲋笜?biāo)維持在正常范圍之內(nèi)，無呼吸困難。3小時(shí)后大鼠出現(xiàn)輕度的CO2潴留，大鼠呼吸頻率增快，部分大鼠呼吸變淺。4小時(shí)后，一只大鼠死亡，三只大鼠呼吸淺快，氧飽和度急劇下降，并出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸性酸中毒，在

15、20分鐘內(nèi)相繼死亡。僅1只大鼠存活時(shí)間超過5小時(shí)。 四、頸髓橫斷前A、B組大鼠的膈肌運(yùn)動(dòng)恢復(fù)率分別為92.18±4.27％、90.46±6.73
　　 ％，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。頸髓橫斷后，B組大鼠呼吸消失，膈肌活動(dòng)度為0。A組大鼠在頸髓橫斷后出現(xiàn)短暫的呼吸抑制，而后胸式呼吸消失，以腹式呼吸為主。膈肌運(yùn)動(dòng)幅度明顯增強(qiáng)，個(gè)別大鼠的呼吸活動(dòng)度甚至超過了C組大鼠的運(yùn)動(dòng)幅度。
　　 五、5只大鼠中有3只大鼠染色較清晰

16、，一只未染色，一只染色較差。CB-HRP的反應(yīng)
　　 產(chǎn)物在明亮視野下呈青蘭色，標(biāo)記的細(xì)胞和軸突的形態(tài)顯示良好。逆行標(biāo)記的細(xì)胞胞體和樹突中的產(chǎn)物呈顆粒性，在疑核中，反應(yīng)產(chǎn)物呈均質(zhì)性或排列極為密集的小顆粒，神經(jīng)元胞體結(jié)構(gòu)清晰，標(biāo)記軸突內(nèi)的產(chǎn)物也為均質(zhì)性。 結(jié)論：
　　 頸部迷走神經(jīng)與膈神經(jīng)位置較近，相對表淺易暴露，且迷走神經(jīng)內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維含量
　　 與膈神經(jīng)相似，適宜吻合。膈神經(jīng)端側(cè)吻合迷走神經(jīng)后，膈神經(jīng)纖維能較好