通心絡抑制動脈粥樣硬化斑塊進展的作用及其機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　Ⅰ通心絡抑制動脈粥樣硬化早期病變滋養(yǎng)血管增生的作用及其機制研究
　　背景：
　　研究表明，滋養(yǎng)血管(vasa vasorum，VV)增生與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的形成、進展及易損性密切相關，而VV增生的程度和分布范圍受到促血管生長因子與抑血管生長因子間相互作用的調節(jié)。其中，血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth

2、 factor，VEGF）家族及血管生成素(angiopoietin，ANGPT)家族起著重要的作用。研究表明，VEGF家族重要成員VEGF-A能夠通過促進單核細胞活化、粘附、遷移及增加內皮細胞的通透性而促進內膜增生、加重AS。人冠狀動脈斑塊免疫組織化學染色顯示，VEGF-A在各個時期的斑塊均有陽性染色，并且其陽性染色率在動脈粥樣化的病變處比彌散性內膜增厚病變處明顯增加。人頸動脈斑塊免疫組化染色顯示，不穩(wěn)定斑塊中血管生成素家族成員ANG

3、PT-1的表達下降而ANGPT-2的表達升高。ANGPT-1與ANGPT-2的比值在出血的斑塊中減小，并且ANGPT-1/ANGPT-2與斑塊新生血管密度呈負相關。血管新生因子的表達受到缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor1α，HIF-1α)，E26轉化特異序列1（E26 transformation specific sequence1，Ets-1）等多種轉錄因子的調控。HIF-1α的蛋白穩(wěn)定性及其轉錄活

4、性受到缺氧依賴性和非缺氧依賴性兩種信號通路的調控。AS斑塊內膜增厚超過氧氣的彌散距離以及斑塊內活躍的炎癥反應狀態(tài)等因素均可引起HIF-1α的表達增加。多種炎癥因子和生長因子可通過激活PI3 K/Akt/HIF-1α通路增加促血管生成因子VEGF-A、ANGPT-2、ANGPT-4等的表達。而Ets轉錄因子家族成員Ets-1可通過與ANGPT-2基因上的Ets結合位點結合而激活ANGPT-2的啟動子活性，增加ANGPT-2的表達。

5、　　復方中藥通心絡(Tongxinluo，TXL)于1996年被我國食品與藥品監(jiān)督管理局批準用于冠心病心絞痛和缺血性腦卒中的治療。本實驗室前期的研究發(fā)現，在小鼠心肌梗死和心力衰竭模型中，TXL干預能夠顯著增加小鼠缺血心肌區(qū)內的新生血管密度、減輕心室重構、改善心功能。那么斑塊VV增生對于早期斑塊的形成有無影響？斑塊VV增生促進早期斑塊形成的機制是什么？TXL在抗心肌缺血的同時是否會對斑塊的血管新生產生相同的促進作用進而對斑塊的發(fā)生及穩(wěn)定性

6、產生影響？
　　基于以上分析，本研究擬采用高脂喂養(yǎng)載脂蛋白E敲基因(apolipoprotein Edeficient，apoE-/-)小鼠建立早期AS斑塊模型，觀察斑塊VV增生對于早期斑塊形成的影響，并進一步探究TXL干預對AS斑塊血管新生以及早期斑塊形成的影響及可能的作用機制，也為該藥在臨床上的應用提供更多實驗依據。
　　目的：
　　1.觀察TXL干預對apoE-/-小鼠斑塊VV增生及早期斑塊形成的影響;
　

7、　2.探討TXL干預影響血管新生的可能機制。
　　方法：
　　1.TXL超微粉及其溶液的制備
　　TXL復方中藥組分制備成直徑≤10μm的超微粉，體內實驗部分，用生理鹽水溶解，制備TXL-生理鹽水混懸液，通過灌胃的方式給藥;體外實驗部分，用細胞基礎培養(yǎng)基溶解制備成TXL儲存溶液。
　　2.實驗動物模型的建立和分組
　　100只12周齡雄性apoE-/-小鼠，高脂飲食1周后，隨機分為生理鹽水對照組（Contr

8、ol組，25只）和TXL干預組（75只）。為觀察TXL的劑量效應，TXL干預組又分為TXL低劑量組（TXL-L，0.38g/kg/d，25只），TXL中劑量組(TXL-M，0.75g/kg/d，25只)和TXL高劑量組（TXL-H，1.5g/kg/d，25只）。Control組給予相同體積的生理鹽水。TXL干預5周后，所有小鼠行安樂死，留取各組小鼠血液及組織標本。
　　結果：
　　1.apoE-/-小鼠的基本情況
　　

9、實驗結束時，所有小鼠均順利通過實驗。各組間小鼠體重無顯著性差異。血液學檢測指標包括血清TG、TC、LDL-C、HDL-C以及血糖水平，在各組小鼠間比較無統(tǒng)計學差異。
　　2.TXL對主動脈環(huán)出芽及AS斑塊VV增生的影響
　　離體主動脈環(huán)出芽實驗表明，與Control組相比，TXL-L、TXL-M、TXL-H組小鼠主動脈環(huán)出芽的數量和新生血管的長度均顯著減少。體內實驗，利用Tomato lectin灌注后，以免疫組織化學染色法

10、顯示血管內皮，與Control組相比，TXL-L、TXL-M、TXL-H組AS斑塊外膜的VV增生均顯著受到抑制。
　　結論：
　　1.TXL干預抑制VV增生可能是其抑制AS早期病變的形成及改善斑塊組織成分的作用機制之一;
　　2.TXL干預抑制VV增生的作用可能與調節(jié)斑塊內血管新生因子的表達有關;
　　3.TXL干預對血管新生因子的調控可能與抑制PI3K/Akt/HIF-1α信號通路有關。
　?、蛲ㄐ慕j抑制

11、動脈粥樣硬化進展期斑塊炎癥性血管新生的作用及其機制研究
　　背景：
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是大、中動脈血管壁的一種慢性、全身炎癥反應性疾病的概念已被人們廣泛接受。炎癥反應貫穿AS病變發(fā)展的各個時期:在脂質條紋形成早期，活化的血管內皮細胞分泌趨化因子及表達粘附分子招募循環(huán)中單核細胞遷移、浸潤至內皮細胞下成為定居的巨噬細胞;斑塊內活化的炎癥細胞分泌金屬基質蛋白酶(matrix metallopr

12、oteinase，MMPs)降解細胞外基質和纖維帽，導致斑塊破裂及血栓形成進而引起臨床不良事件的發(fā)生。
　　多年來炎癥對AS斑塊進展的研究多集中于其介導的固有免疫和適應性免疫反應，而近年來越來越多的研究表明炎癥在斑塊內血管新生增加AS斑塊易損性的過程中扮演著重要角色。AS易損斑塊的病理組織學特征為大的偏心脂質核心、薄的纖維帽、活躍的炎癥反應、血管正性重構、斑塊內大量血管新生及滋養(yǎng)血管(vasa vasorum，VV)增生等。近期的

13、影像學研究表明，在發(fā)生急性冠脈綜合征的病例中大多伴有近期內斑進展速率增加的現象。斑塊迅速增大的可能機制為:1)未導致臨床心血管事件的斑塊的反復破裂與修復;2）斑塊內新生血管的滲漏導致富含膽固醇的紅細胞膜在斑塊內堆積及炎癥加劇;3）斑塊內新生血管的破裂導致斑塊體積增大、膽固醇積聚和氧化應激加劇。
　　在本論文第一部分的研究中，我們發(fā)現早期應用中藥通心絡(Tongxinluo，TXL)能夠通過調節(jié)斑塊內血管新生相關因子的表達抑制斑塊外

14、膜VV增生進而抑制早期斑塊的形成，但是TXL對斑塊內已經形成的VV增生和進展期斑塊內血管新生以及炎性狀態(tài)下內皮細胞血管新生能力的影響仍不明確。
　　因此，本研究擬在高脂喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E deficient，apoE-/-)小鼠AS進展期斑塊模型中，觀察TXL對進展期斑塊內炎癥性血管新生及斑塊穩(wěn)定性的影響，并在體外實驗中探究TXL溶液對炎癥因子TNF-α誘導的內皮細胞血管新生的影響及可能的作

15、用機制。
　　目的：
　　1.觀察TXL對apoE-/-小鼠AS進展期斑塊中已經形成的VV增生、斑塊內血管新生及斑塊穩(wěn)定性的影響;
　　2.觀察TXL溶液對炎性狀態(tài)下內皮細胞血管新生的影響;
　　3.探討TXL干預影響炎癥性血管新生的可能機制。
　　方法：
　　1.實驗動物模型的建立和分組
　　100只10周齡雄性apoE-/-小鼠，高脂飲食20周后，隨機分為生理鹽水對照組(Control，n=

16、25)，TXL低劑量組(TXL-L，0.38g/kg/d，n=25)，TXL中劑量組(TXL-M，0.75g/kg/d，n=25)和TXL高劑量組(TXL-H，1.5g/kg/d，n=25);Control組給予相同體積的生理鹽水。所有apoE-/-小鼠全程高脂飲食，TXL干預16周后，小鼠行安樂死，留取各組小鼠血液及組織標本。
　　2.血液學指標檢測
　　實驗結束末，檢測各組小鼠血清甘油三酯（triglycerides，T

17、G）、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇酯(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇酯（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）以及血糖水平。
　　結果：
　　1.各組小鼠一般狀況觀察
　　實驗結束時，共有10只小鼠死亡，其中Control組小鼠死亡3只，TXL-L組死亡3只

18、，TXL-M組及TXL-H組各死亡2只。小鼠體重在各組間無統(tǒng)計學差異，血脂四項以及血糖水平在四組小鼠間均未有統(tǒng)計學差異。
　　2.TXL干預對斑塊外膜滋養(yǎng)血管增生及斑塊內血管新生的影響
　　與Control組相比，TXL各劑量干預組均能夠顯著減少斑塊外膜VV增生及斑塊內血管新生，并且這一抑制作用呈劑量依賴性。
　　結論：
　　1.進展期斑塊中炎癥及血管新生因子的高表達可能是促進斑塊血管新生的主要機制;