人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽的表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是一種多功能蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)超家族成員之一，為目前發(fā)現(xiàn)的一類具有異位成骨能力的細(xì)胞因子，它能刺激間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(qaBMP-7)又稱為成骨蛋白-1(OP-1)，由于其具有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力而受到人們廣泛關(guān)注。它與I型膠原蛋白的緩釋體移入骨干缺損部位，會(huì)導(dǎo)致有功能的新骨形成，顯示出應(yīng)用于骨與關(guān)節(jié)及軟骨缺損修復(fù)的前景。而且同時(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)的分化發(fā)育也有調(diào)控作用

2、。 hBMP-7基因編碼431個(gè)氨基酸，由N端的信號(hào)肽、中間區(qū)域的前肽和C端的成熟肽三部分組成，翻譯后的前體需要進(jìn)一步的加工修飾，包括切掉信號(hào)肽和前肽，其成骨活性主要表現(xiàn)在C端的成熟肽區(qū)。hBMP-7成熟肽含有139個(gè)氨基酸，單體分子量約15.7kD，帶有3個(gè)糖基化位點(diǎn)及7個(gè)半胱氨酸殘基。天然hBMP-7存在同源或異源二聚體形式，二聚體的hBMP-7是其生物學(xué)活性的主要形式。制備hBMP-7成熟肽主要的研究工作包括以下三個(gè)方面：

3、 1．采用pMAL-p2x表達(dá)載體，在原核系統(tǒng)中獲得了hBMP7-MBP融合蛋白的可溶性高效表達(dá)，并通過親和純化得到純度約為80％的融合蛋白，利用Factor Xa蛋白酶對(duì)融合蛋白酶切后，得到目的蛋白hBMP-7成熟肽，以單體形式存在。 2．鑒于畢氏酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)能對(duì)重組蛋白進(jìn)行翻譯后必要的剪接、正確的折疊和修飾，糖基化形式更接近于高等真核生物，因此選用此表達(dá)系統(tǒng)，將hBMP-7成熟肽基因

4、克隆入表達(dá)載體pPIC9K，用Sal I酶將重組質(zhì)粒線性化，電轉(zhuǎn)化入Pichia pastoris SMD1168細(xì)胞，G418抗性篩選出陽性整合子，確定Mut<'+>表型進(jìn)行甲醇快速誘導(dǎo)，并對(duì)其培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件進(jìn)行一定的探索和優(yōu)化。經(jīng)過整合子的篩選和表達(dá)條件的優(yōu)化，最終篩選到目的蛋白表達(dá)量占上清蛋白8％的分泌表達(dá)株，表達(dá)量為0.6mg/L，酶聯(lián)免疫檢測(cè)及蛋白印跡結(jié)果表明，表達(dá)的重組蛋白與抗hBMP-7抗體具有特異結(jié)合活性，提示重組表達(dá)蛋

5、白具有天然蛋白的分子構(gòu)象。 3．為了提高目的蛋白的表達(dá)量，依據(jù)畢氏酵母的密碼子偏好性，對(duì)hBMP-7成熟肽基因進(jìn)行基因修飾，最終確定以含三個(gè)精氨酸突變位點(diǎn)的酵母菌作為表達(dá)株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)Ni-NTA柱純化得到純度為80％的蛋白樣品，基因修飾后的hBMP-7成熟肽在畢氏酵母中的表達(dá)水平提高了約4倍，產(chǎn)量為2.5mg/L。所得hBMP-7成熟肽在還原狀態(tài)下以分子量約18kD的單體形式存在，在非還原狀態(tài)下以二聚體形式存在，分子量約為