細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的恩替卡韋肝腎轉(zhuǎn)運(yùn)研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎是一種以肝臟炎性病變?yōu)橹髑铱刹l(fā)多器官損害的世界性疾病，發(fā)病機(jī)制由乙肝病毒(HBV)引起，且可轉(zhuǎn)化為肝硬化(LC)和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)。臨床上對(duì)慢性乙肝(CHB)的治療采取綜合措施，包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎及改善肝功能等，其中抗病毒治療已公認(rèn)是治療慢性乙型肝炎的關(guān)鍵。以往的抗病毒藥物在臨床應(yīng)用中均有其局限性。恩替卡韋(ETV)是美國FDA于2005年批準(zhǔn)，用于治療慢性乙肝病毒感染的新核苷類似物藥物，對(duì)HBV的復(fù)制有

2、很強(qiáng)抑制作用，已成為目前乙肝治療一線用藥。腎臟為ETV主要排泄器官，肝臟為其作用靶器官，但ETV極性較大，生理pH條件下易電離為陽離子態(tài)（pKa=10.5），難以被動(dòng)擴(kuò)散方式直接跨膜，推測細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（轉(zhuǎn)運(yùn)體）在ETV的肝、腎轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮了重要作用。
　　人腎臟特異性表達(dá)的多藥及毒素外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hMATE2-K)是2006年首次從人腎臟近曲小管克隆表達(dá)的H+/有機(jī)陽離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。與該家族另一亞型MATE1及一些ABC類轉(zhuǎn)運(yùn)體

3、共同表達(dá)在腎近曲小管上皮細(xì)胞頂側(cè)膜，與底側(cè)膜表達(dá)的一些攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體，共同完成陽離子化合物及部分中性及陰離子樣物質(zhì)的腎臟排泄。根據(jù)ETV的結(jié)構(gòu)，推測包括hMATE2-K在內(nèi)的許多轉(zhuǎn)運(yùn)體可能介導(dǎo)其肝腎轉(zhuǎn)運(yùn)。由于永生化肝、腎細(xì)胞系，轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)往往很低甚至丟失，因此穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型，是體外研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的理想模型。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建并保存了許多轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型，但尚沒有穩(wěn)定表達(dá)hMATE2-K的細(xì)胞模型，因而本文首先構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人MATE

4、2-K的MDCKⅡ細(xì)胞模型，并將其與實(shí)驗(yàn)室已有的其它細(xì)胞模型以及小鼠原代腎小管細(xì)胞和肝細(xì)胞，用于探究ETV的肝、腎轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
　　1.穩(wěn)定表達(dá)hMATE2-K的MDCKⅡ細(xì)胞模型的構(gòu)建
　　本章旨在建立穩(wěn)定表達(dá)人MATE2-K（hMATE2-K）的馬丁達(dá)比狗腎上皮(Madin-Darby canine kidney2，MDCKⅡ)細(xì)胞模型。首先，以pCMV-SLC47A2質(zhì)粒為模板，通過分子克隆技術(shù)，構(gòu)建含有正確hMATE2

5、-K cDNA序列的pcDNA3.1(+)-hMATE2-K重組質(zhì)粒，經(jīng)lipo2000轉(zhuǎn)染MDCKⅡ細(xì)胞及潮霉素B抗性篩選，并以經(jīng)典底物(1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+)、二甲雙胍）的積聚、mRNA水平及蛋白水平檢測驗(yàn)證挑選出的單克隆細(xì)胞，獲得穩(wěn)定高表達(dá)hMATE2-K的MDCKⅡ細(xì)胞模型。結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的MDCKⅡ-hMATE2-K細(xì)胞模型中hMATE2-K mRNA水平約為mock細(xì)胞的50

6、00倍，且檢測到hMATE2-K蛋白表達(dá)，同時(shí)對(duì)MPP+、二甲雙胍的積聚量分別為轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞的50、20倍，在經(jīng)典抑制劑西咪替丁或奎尼?。?00μM）存在下可使積聚量降低到mock細(xì)胞水平，且構(gòu)建的模型細(xì)胞對(duì)經(jīng)典底物積聚動(dòng)力學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)接近。上述結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)hMATE2-K的細(xì)胞模型構(gòu)建成功，可用于研究hMATE2-K介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及藥物-藥物相互作用研究。
　　2.恩替卡韋與腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用研究
　　本章旨

7、在應(yīng)用上章構(gòu)建的細(xì)胞模型及實(shí)驗(yàn)室已有的穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)體的細(xì)胞模型，研究ETV的腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。首先利用MDCKⅡ-hMATE1、hMATE2-K細(xì)胞模型，考察了ETV對(duì)hMATEs介導(dǎo)的MPP+攝取的抑制作用。結(jié)果表明，ETV對(duì)hMATE1、hMATE2-K抑制作用較弱，50μM濃度下抑制率約50％;進(jìn)一步對(duì)其在MDCKⅡ-hMATE1、hMATE2-K及mock細(xì)胞中的積聚進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ETV在轉(zhuǎn)染了hMATEs模型細(xì)胞中的積聚顯著高于m

8、ock細(xì)胞，且可被hMATEs的抑制劑西咪替丁及奎尼?。?00μM）抑制，提示ETV為hMATE1、hMATE2-K的底物，進(jìn)一步研究獲得ETV在MDCKⅡ-hMATE1、hMATE2-K中積聚的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Eadie-Hofstee作圖法顯示，該積聚呈非典型動(dòng)力學(xué)，低濃度下（50-400μM），Km均為0.30mM，Vmax則分別為0.90、3.1nmol/mg protein/min;高濃度下（400-3000μM），Km分別為1.

9、5、1.1mM，Vmax則分別為2.7、6.5nmol/mg protein/min。
　　還應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)hOCT2、hOCTN1/2、hMDR1及hMRP2的MDCKⅡ細(xì)胞模型，研究ETV與腎臟其它轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用。結(jié)果顯示，ETV為hOCT2，hOCTN1/2的底物，且在hOCT2及hOCTN1/2上的積聚呈典型動(dòng)力學(xué)，Km分別為0.3、2.8及2.2mM，Vmax則分別為1.0、4.3及3.0nmol/mg protein/

10、min。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)ETV為hMDR1與hMRP2的底物。在上述的研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用原代培養(yǎng)的小鼠腎小管上皮細(xì)胞，驗(yàn)證各轉(zhuǎn)運(yùn)體在腎小管細(xì)胞處置ETV中的作用。結(jié)果表明，Oct2，Oats，Octn1/2及Mrp2的抑制劑與ETV共孵育后，均可影響胞內(nèi)ETV的濃度?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，推測部分ETV可經(jīng)由腎小管上皮細(xì)胞底側(cè)膜的hOCT2、hOAT1/3從血液側(cè)攝取進(jìn)入腎小管細(xì)胞，并在頂側(cè)膜表達(dá)的hMDR1，hMRP2及hMATE1/2-

11、K的作用下外排至尿液，一部分可經(jīng)hOCTN1/2重吸收回腎臟。
　　3.恩替卡韋與肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用研究
　　本章旨在應(yīng)用小鼠原代肝細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)室已有的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型，研究肝細(xì)胞血竇側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)體在ETV肝臟攝取中的作用。首先應(yīng)用原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞，在4℃及37℃下探究ETV在細(xì)胞內(nèi)的積聚差異，同時(shí)考察各類轉(zhuǎn)運(yùn)體經(jīng)典抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)積聚的影響，推測參與ETV肝臟處置的轉(zhuǎn)運(yùn)體類型。結(jié)果顯示，有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(OATs)經(jīng)典抑制劑丙磺