lncRNA ZNF674-1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制.pdf

1、目的：鼻咽癌是鼻咽上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤，其發(fā)病率具有顯著的地域性，在以廣東省為主的中國南方省份高發(fā)，中國南方省份的發(fā)病率明顯高于其它地區(qū)20-30倍。鼻咽癌發(fā)病部位比較隱匿，早期癥狀不明顯，同時具有高度侵襲性，所以鼻咽癌確診時大多已經(jīng)處于中晚期，預(yù)后較差。目前鼻咽癌的治療主要以放療為主，但放療具有許多局限與不足，比如鼻咽癌的輻射抗性以及放療帶來的諸多副作用都影響著患者的生存率和生活質(zhì)量。因此研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制以及探尋可能的特異性腫瘤

2、標(biāo)志物，對鼻咽癌的早期診斷、特異性生物治療以及預(yù)后評估有著重要的臨床指導(dǎo)意義，也將產(chǎn)生巨大的社會效益。LncRNA是長度大于200bp的核苷酸序列，通過影響組蛋白重塑、染色質(zhì)修飾、基因印跡等作用來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而與引起細(xì)胞水平的變化。近年來許多研究表明，LncRNA的異常表達(dá)與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它通過不同方式來影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。因此，我們以鼻咽癌作為研究對象，結(jié)合臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究，探尋lncRNA ZNF674-

3、1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，旨在為鼻咽癌的早期診斷、臨床治療以及預(yù)后判斷提供重要的特異性的生物標(biāo)志物。
　　方法：我們先用qRT-PCR檢測lncRNA ZNF674-1在正常鼻咽上皮NP460和兩株鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B中表達(dá)量的差異，確定其具有比較明顯的表達(dá)差異之后，我們在24例鼻咽癌組織和24例正常鼻咽上皮組織中驗證其表達(dá)差異。證實了lncRNA ZNF674-1在鼻咽癌細(xì)胞系和臨床鼻咽癌組織中都具有明顯的表達(dá)

4、差異后，我們用CCK8實驗來探查lncRNA ZNF674-1對鼻咽癌細(xì)胞增殖功能的影響；再用劃痕實驗和Transwell遷移實驗來探查lncRNA ZNF674-1對鼻咽癌細(xì)胞遷移
　　功能的影響；然后用Transwell侵襲實驗來驗證lncRNA ZNF674-1對鼻咽癌細(xì)胞侵襲功能的影響；最后用流式細(xì)胞術(shù)檢測lncRNA ZNF674-1對鼻咽癌細(xì)胞凋亡功能的影響。
　　結(jié)果：lncRNA ZNF674-1在鼻咽癌細(xì)胞

5、系中（6-10B和CNE2）的表達(dá)水平比在正常鼻咽上皮細(xì)胞系（NP460）中的表達(dá)水平顯著降低，同樣lncRNA ZNF674-1在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平較在正常鼻咽上皮組織中的表達(dá)水平也顯著降低。首先我們構(gòu)建能夠敲低lncRNA ZNF674-1表達(dá)量的干擾RNA(si-ZNF674-1)和以AVD4為載體構(gòu)建過表達(dá)lncRNA ZNF674-1的腺病毒（AVD4-ZNF674-1），同時構(gòu)建si-ZNF674-1和AVD4-ZNF6

6、74-1陰性對照，分別是si-NC和AVD4-NC。熒光顯微鏡下驗證其轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到90以上， qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染si-ZNF674-1能夠顯著敲低lncRNA ZNF674-1在鼻咽癌細(xì)胞細(xì)胞系CNE2和6-10B中的表達(dá)量（其中在CNE2細(xì)胞系中能敲低71.2％lncRNA ZNF674-1的表達(dá)，在6-10B細(xì)胞系中能敲低78.8%lncRNA ZNF674-1的表達(dá)）；鼻咽癌細(xì)胞感染AVD4-ZNF674-1后能夠使鼻咽癌細(xì)

7、胞穩(wěn)定的過表達(dá)lncRNA ZNF674-1（其中在CNE2細(xì)胞系中能夠使lncRNA ZNF674-1表達(dá)量提高897倍，在6-10B細(xì)胞系中能夠使lncRNA ZNF674-1的表達(dá)量提高1370倍）。CCK8實驗表明，轉(zhuǎn)染si-ZNF674-1后能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B的增殖，而感染AVD4-ZNF674-1后能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B的增殖；Transwell遷移實驗和劃痕實驗表明，轉(zhuǎn)染si-ZNF

8、674-1后能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B的遷移，而感染AVD4-ZNF674-1后能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B的遷移；Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-ZNF674-1后能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B的侵襲，而感染AVD4-ZNF674-1后能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B的侵襲；流式細(xì)胞術(shù)實驗顯示轉(zhuǎn)染si-ZNF674-1后能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B的凋亡，而感染AVD4-

9、ZNF674-1后能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B的凋亡。
　　結(jié)論：lncRNA ZNF674-1的表達(dá)量在鼻咽癌組織和鼻咽癌細(xì)胞中均較正常鼻咽上皮組織和正常鼻咽上皮細(xì)胞中低。細(xì)胞功能實驗證明，在鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和6-10B中敲低lncRNA ZNF674-1表達(dá)量后可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制鼻咽癌細(xì)胞的凋亡；而過表達(dá)lncRNA ZNF674-1則可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時促進(jìn)鼻咽癌