人細胞中hIWS1因子生物學特性的研究.pdf

1、第二類RNA聚合酶(RNApolymeraseⅡ，RNAPⅡ)主導的基因轉(zhuǎn)錄過程中，轉(zhuǎn)錄延伸是一個高度調(diào)控的過程，其中涉及許多的調(diào)控因子參與RNAPⅡ活性的調(diào)控。目前已經(jīng)有許多的RNAPⅡ轉(zhuǎn)錄延伸因子被鑒定，但仍有不少的因子處于待了解狀態(tài)，酵母方面的研究認為IWS1是一個新的RNAPⅡ轉(zhuǎn)錄延伸因子。本研究在人細胞中鑒定了hIWS1(humanIWS1)因子，并且在此基礎上，對hIWS1的一些生物學特性進行了研究。另外，PRMT5是蛋白質(zhì)

2、精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(proteinargininemethyltransferases,PRMTs)家族中一個重要的成員，它能夠?qū)彼?R)進行單甲基化和對稱性雙甲基化翻譯后修飾。最近有研究發(fā)現(xiàn)PRMT5能參與RNAPⅡ轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控。為此，本研究探索了人細胞中hIWS1與PRMT5的關系。 1.hIWS1的克隆、表達與鑒定 1.1從人的293T細胞中提取總RNA，將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成為第一鏈cDNA作為PCR擴增hI

3、WS1cDNA的模板。然后根據(jù)GenBank中所預測的hIWS1的cDNA序列(登錄號：AL834178)設計相應的PCR引物。利用這些特異性的引物，本研究擴增得到hIWS1的N端(hIWS1-N391)和C端(hIWS1-C297)編碼cDNA，然后利用這兩個cDNA片段獲得了全長hIWS1，經(jīng)測序證明克隆得到的hIWS1序列與GenBank中AL834178的序列完全一致。這表明人細胞中存在成熟的hIWS1的mRNA，并且mRNA成

4、熟過程中的剪接機制符合GenBank中所預測的情況。 1.2根據(jù)AL834178所預測的開放性閱讀框(openreadingframe，ORF)，將hIWS1-N391克隆到pET-22b形成表達重組質(zhì)粒pET22b-N391，然后將pET22b-N391轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。結(jié)果表明，在大腸桿菌BL21(DE3)中pET22b-N391的表達產(chǎn)物主要在上清中；并且IPTG誘導以后，pET22b-N3

5、91在16℃表達16h能夠產(chǎn)生更高的產(chǎn)量。 將大腸桿菌破碎液的上清加入到Ni-NTA純化柱中，然后用含20mM咪唑的PBS充分洗滌后，最后用含100mM咪唑的PBS能純化得到質(zhì)量較好的pET22b-N391。 1.3將純化得到的hIWS1-N391蛋白免疫大白兔制備多克隆抗體，該抗體特異地識別AL834178所預測蛋白上的第3至391位氨基酸。用該抗體對HCT116細胞中總蛋白進行western雜交實驗，結(jié)果有兩個蛋白被

6、特異性地識別，其中信號最強的蛋白大小約92kDa，與AL834178所預測蛋白的分子量一致。該結(jié)果證明人細胞中存在hIWS1蛋白因子，并進一步表明該因子嚴格地遵循GenBank中AL834178所預測的ORF。 2.小鼠Iwsl(mIws1)的組織表達分析 由于hIWS1與它的小鼠同源物(mouseIWS1，mIWS1)具有很高的同源性(84％的相似性)，因此本研究利用小鼠為實驗對象研究動物中IWS1的組織表達分布情況。

7、首先從小鼠體內(nèi)分離出有關器官組織，其中包括大腦、心臟、肝臟、肺、脾臟、胃、腎臟、前列腺、睪丸、子宮、大腸與小腸。接著將這些器官組織中的總RNA提取出來并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以這些cDNA為模板進行半定量RT-PCR分析。結(jié)果表明mIWS1是個組織器官普遍性表達的因子；并且在不同器官組織中的表達量差異較大，其中腎臟中表達量最高，其次是睪丸、大腸、小腸與脾臟，而心臟中的表達量最低。這些結(jié)果意味著IWS1對于動物機體是個必需因子，并且它的功

8、能具有組織偏好性。 3.hIWS1的亞細胞定位 3.1將hIWS1的全長cDNA構建到綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-C1中，然后將該重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HCT116和U2OS細胞。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明GFP-hIWS1在細胞中表達后主要定位在細胞核中，說明hIWS1因子是個核蛋白。 3.2針對hIWS1的核蛋白特性，對hIWS1因子的肽鏈序列進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在hIWS1因子的兩個功能域的銜接區(qū)(第350至557位氨

9、基酸之間)有幾個類似核定位信號(nuclearlocalizationsignals，NLSs)的基序。為了檢驗這個銜接區(qū)是否具有NLSs作用，將hIWS1cDNA的各種缺失突變體構建到綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-C1中，然后將這些重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HCT116。熒光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明GFP-N391分布在細胞核內(nèi)，而GFP-N355主要分布在細胞質(zhì)中，這些結(jié)果表明在hIWS1因子的第356位至第391位氨基酸之間含有NLSs。類似

10、地，GFP-C389定位在細胞核內(nèi)，而GFP-△WT(缺失第356至524位氨基酸)卻同時分布在細胞核與細胞質(zhì)內(nèi)，這些結(jié)果表明hIWS1因子第389位氨基酸至第524位氨基酸之間也含有NLSs。 4.hIWS1因子對細胞生長的影響 4.1參考AL834178的cDNA序列選擇3個靶序列，并設計成shRNA引物，然后將合成的引物克隆到shRNA表達載體pNeoU6+1上構建成RNAi重組質(zhì)粒，分別命名為sh1，sh2和sh

11、3。為了粗略地估計這幾對shRNA的RNAi效果，將GFP-WT分別與sh1，sh2，sh3和空白對照shLF共轉(zhuǎn)染HCT116，結(jié)果表明這3對shRNA都具有RNAi效果，不過sh2的RNAi效果較弱，而sh1和sh3卻能夠很有效地抑制細胞中hIWS1的表達。 4.2用以上各種shRNAs和對照質(zhì)粒shLF轉(zhuǎn)染HCT116細胞，然后進行細胞克隆試驗。結(jié)果表明與對照shLF組相比，sh2組的細胞克隆數(shù)量略少；而sh1和sh3組的

12、細胞克隆數(shù)量卻劇烈減少，并且所生長的細胞克隆形態(tài)較小。Western雜交實驗表明各組試驗中細胞克隆的差異是由于細胞中hIWS1因子被特異地抑制所引起的。這些結(jié)果證明細胞中hIWS1因子表達量降低后會降低細胞的存活能力和生長能力，表明hIWS1因子是細胞生存的必需因子。 5.hIWS1和PPMT5的關系 5.1用抗PRMT5抗體與抗hIWS1抗體對HCT116細胞中的總蛋白進行免疫共沉淀實驗，然后用抗hIWS1抗體對免疫共

13、沉淀結(jié)果進行western雜交檢驗。結(jié)果表明抗PRMT5抗體與抗hIWS1抗體都能沉淀分離出hIWS1因子，并且這種沉淀分離是特異的，因為空白對照和免疫前血清均不能將hIWS1因子沉淀出來。這些結(jié)果表明人細胞中hIWS1和PRMT5之間存在物理性結(jié)合。 5.2將抑制hIWS1表達的sh1、抑制PRMT5表達的shRM5以及對照shLF轉(zhuǎn)染HCT116細胞，然后分別用抗hIWS1抗體和抗PRMT5抗體進行Western雜交檢驗。結(jié)