非典型趨化因子受體CCRL1對肝細胞癌生物學特性的影響.pdf

1、肝細胞肝癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一[1]，我國是肝癌的高發(fā)國家，約占全球肝癌病例一半以上[2]。雖然肝癌研究已取得很大進展，但由于肝癌的疾病過程進展迅速、具有極高的復發(fā)轉移傾向，致使肝癌總體療效仍然不佳。目前，肝腫瘤切除術和肝移植仍然是治療肝細胞肝癌的最有效的標準方案[3]，術后5年內(nèi)仍有50％-70％復發(fā)率。因此探索肝癌轉移復發(fā)的機制，了解腫瘤的侵襲轉移能力，預測患者預后，尋找有效的抑制途徑，并在復發(fā)高危人群中進行防治成為進一

2、步提高肝癌生存率的關鍵。
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移是一個多步驟的復雜動態(tài)過程。只有從微環(huán)境與肝癌相互作用的角度進行了綜合研究，才能全面、深刻認識肝癌發(fā)生發(fā)展和轉移復發(fā)的內(nèi)在機制。在這一過程中有多種因素如細胞因子、生長因子、細胞粘附分子、細胞外蛋白酶和血管生成因子等參與。越來越多的研究表明趨化因子及其受體與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，特別是在腫瘤的細胞生長、遷徙轉移、血管形成以及免疫細胞在腫瘤的浸潤方面可能起到關鍵的作用。
　

3、　本研究主要探討非典型的趨化因子受體CCRL1對肝細胞癌生物學特性的影響。利用組織芯片技術對240例原發(fā)性肝癌手術切除的患者進行分析，發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中CCRL1的表達明顯降低，并且低表達組的患者預后要明顯差于高表達組。隨后通過慢病毒轉染技術，調控CCRL1在肝癌細胞系的表達，通過一系列體外和體內(nèi)實驗，研究CCRL1的表達對肝癌細胞生長增殖、侵襲轉移方面的影響，最后探討CCRL1抗腫瘤效應的可能機制，為防治肝癌提供新的可能靶點。
　

4、　第一部分 CCRL1在肝癌組織中的表達及其臨床意義研究
　　本研究旨在探索CCRL1在癌、癌旁組織以及肝癌細胞系中的表達情況，以及表達水平與患者預后的相關性
　　首先對240例原發(fā)性肝癌手術切除的患者的癌和癌旁組織進行CCRL1的免疫組化染色，并通過Image-Pro Plus6.0軟件(IPP，Media Cybernetics)對染色照片進行平均光密度的測定。然后運用Real-time RT-PCR和Western b

5、lot技術在6種肝癌細胞系中檢測CCRL1的表達情況。最后將患者CCRL1的染色情況與相關臨床資料進行了綜合分析，判斷CCRL1作為患者預后指標的價值。
　　本研究顯示，CCRL1在癌組織中的表達要明顯低于癌旁組織(P=0.015)，可見在癌組織中存在CCRL1的缺失。對細胞系的檢測中發(fā)現(xiàn)，CCRL1在不同的肝癌細胞系中存在表達差異，特別是在MHCC97H(97H)，MHCC97L(97L)和MHCCM3(M3)這三株細胞胞系中，

6、隨著細胞侵襲轉移能力的提高(97L＜97H＜M3)，CCRL1的表達同步降低(97L＞97H＞M3)，這提示CCRL1可能具有抑制腫瘤侵襲轉移的潛能。240例患者的臨床及隨訪資料顯示，CCRL1的低表達與肝癌的血管侵犯(P=0.038)和腫瘤低分化(P=0.037)顯著相關。低表達CCRL1的患者，其總生存率(P＜0.001)和無瘤生存率(P=0.002)要顯著低于高表達組。Cox回歸多因素分析顯不，CCRL1與腫瘤數(shù)目、血管侵犯一樣，

7、是評價患者總生存(hazard ratio，HR=0.579;95％ confidence interval，CI=0.411-0.816; P=0.002)和無瘤生存(HR=0.657;95％ CI=0.462-0.934; P=0.019)的獨立危險因素。
　　以上結果表明，低表達CCRL1的肝癌細胞惡性程度高，患者的預后差。對CCRL1表達量的檢測有助于對肝癌術后復發(fā)的預測以及高危病例的預防性治療。
　　第二部分調節(jié)C

8、CRL1表達對肝癌細胞生物學特性的影響
　　本研究旨在通過建立細胞及動物模型，探索CCRL1在體外以及體內(nèi)實驗中對腫瘤細胞生長、遷移、侵襲以及轉移等生物學行為的影響。
　　利用慢病毒載體在97L和M3細胞系中分別轉染shCCRL1敲除質粒和CCRL1過表達質粒，從而構建97L-shCCRL1和M3-CCRL1穩(wěn)定細胞系。隨后借助Cell-IQ系統(tǒng)檢測轉染前后的增殖能力的變化;劃痕實驗檢測遷移能力的變化;Transwell小室

9、實驗檢測細胞侵襲能力的改變。進一步通過建立裸鼠皮下成瘤和原位成瘤模型，研究轉染前后細胞成瘤能力和肺轉移情況。同時通過ELISA檢測了細胞上清和小鼠原位成瘤瘤體內(nèi)的CCL19和CCL21的含量。
　　結果顯示，體外實驗中下調CCRL1的表達后，肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力都明顯提高，而且上清CCL19和CCL21的量也顯著上升。反之，過表達CCRL1后，增殖、遷移、侵襲能力和CCL19和CCL21的量均下降。體內(nèi)實驗中，低表達組成

10、瘤的大小顯著高于高表達組(P＜0.05)，且具有更多的肺轉移(P＜0.05)。
　　體內(nèi)外實驗表明，CCRL1能夠抑制肝癌細胞增殖，降低遷移和侵襲能力，并提示CCRL1可能成為肝癌治療的新靶點。
　　第三部分 CCRL1對肝細胞癌生物學特性影響機制的研究
　　為了探討CCRL1抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的內(nèi)在機制，本研究從腫瘤細胞本身和對微環(huán)境的改變兩方面入手。一方面，CCRL1通過降低其配體(CCL19，CCL21

11、)的濃度，從而影響腫瘤細胞上這些配體另外的受體(CCR7)的功能，進而發(fā)揮抗腫瘤的作用。另一方面，CCRL1高表達后也能引起一些趨化因子的上調，而這些趨化因子與一些淋巴細胞的募集有關，本實驗主要集中在對腫瘤浸潤的B淋巴細胞的研究。
　　首先對HCC患者肝癌組織的連續(xù)切片進行了免疫組化染色，指標包括CCRL1，CCL19，CCL21和CCR7。借助western blot技術，在已建立的細胞系97L-shCCRL1對多條信號通路的分

12、子進行了檢測，并運用siRNA技術下調了CCR7后檢測了腫瘤細胞增殖和侵襲能力以及信號通路的變化。另一方面，通過不連續(xù)梯度離心將浸潤組織的CD20+B淋巴細胞分出，運用細胞流式和免疫熒光技術對其表型和產(chǎn)生的細胞因子進行鑒定，并通過和腫瘤細胞共培養(yǎng)，研究其對腫瘤細胞的直接作用。
　　免疫組化結果顯示，CCRL1的表達與CCL19、CC L21和CCR7存在呈顯著負相關。Western blot結果顯示CCRL1下調后，Akt/GSK

13、-3β的磷酸化程度明顯上升，提示CCRL1可能通過該信號通路對腫瘤細胞的增殖侵襲進行調控，而這一過程受到腫瘤自身CCR7的影響。浸潤組織的B淋巴細胞主要集中在腫瘤交界區(qū)，交界區(qū)中的B細胞表現(xiàn)為IgD-IgG+CD27-CD38-的表型，能夠產(chǎn)生IFN-γ和IL-12，同時還能夠通過granzyme B和TRAIL對腫瘤進行直接殺傷，并且其密度還與患者的預后相關。
　　綜合以上結果，我們認為高表達腫瘤細胞的CCRL1，能夠降低CCL