鯉魚FcRγ基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、Fc受體是免疫細(xì)胞表面一類重要受體分子，通過與免疫球蛋白Fc段結(jié)合觸發(fā)多種生物學(xué)功能，是聯(lián)系體液免疫和細(xì)胞免疫的橋梁。Fc受體定位于效應(yīng)細(xì)胞表面通過與免疫球蛋白Fc段特異結(jié)合并觸發(fā)細(xì)胞活動(dòng)，發(fā)揮各種生物學(xué)功能，如調(diào)理吞噬，清除免疫復(fù)合物，介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒作用，介導(dǎo)免疫抑制作用，介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)和炎性介質(zhì)的釋放等。Fc受體多是作為一個(gè)多亞基的復(fù)合體來發(fā)揮功能的，一般由一到三種亞基構(gòu)成：α亞基、β亞基和γ二聚體。其中只有α亞基能與免疫球

2、蛋白Fc段結(jié)合，β亞基不能單獨(dú)完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，僅對傳遞給γ鏈的信號(hào)起到了放大作用，γ鏈?zhǔn)窍掠涡盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，但目前對魚類中γ鏈的研究尚不清楚。 本實(shí)驗(yàn)以鯉魚(Cyprinus carpio L.)為研究材料，Trizol法分別提取鯉魚口腔上皮、鰓、腸、肝臟、脾臟、腎臟、皮膚、心臟、肌肉組織總RNA，RT-PCR方法克隆鯉魚FcRγ，用生物信息學(xué)方法對該序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析，并對其在各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。通過鰻弧菌免疫

3、刺激實(shí)驗(yàn)，Real-timePCR技術(shù)檢測FcRγ基因在組織中表達(dá)水平的變化，從而研究FcRγ在鯉魚免疫中的作用。構(gòu)建pcDNA3.1/Myc-His(+)-FcRγ重組質(zhì)粒，對小鼠進(jìn)行基因免疫制備抗血清。Western blot檢測抗血清特異性，免疫瓊脂雙向擴(kuò)散測定抗血清的效價(jià)，免疫組化研究FcRγ的組織分布。結(jié)果如下： (1)本研究中克隆的FcRγ的cDNA序列由539個(gè)堿基組成，其中包括47bp的5'非翻譯區(qū)和222bp的

4、3'非翻譯區(qū)，其開放讀碼框編碼89個(gè)氨基酸，其中前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，其成熟產(chǎn)物為一次跨膜的蛋白，跨膜區(qū)含有一個(gè)保守的帶負(fù)電荷的天冬氨酸，與α亞基跨膜區(qū)的精氨酸或組氨酸相互作用。第63-83個(gè)氨基酸是FcRγ發(fā)揮生物學(xué)作用的關(guān)鍵區(qū)域ITAM基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，免疫受體酪氨酸活化基序)，ITAM基序本身的磷酸化，可募集胞質(zhì)中酪氨酸激酶，使信號(hào)分子磷酸化

5、，激活免疫細(xì)胞。不同物種FcRγ基因序列之間的同源性分析顯示，F(xiàn)cRγ基因存在著種屬差異性，在蛋白水平上，F(xiàn)cRγ基因各物種間都存在19-23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，成熟蛋白含有一個(gè)ITAM基序，魚類的FcRγ與哺乳類的FcRγ結(jié)構(gòu)相似，推斷也具有相似的功能。 (2)對RNA進(jìn)行定量分析后，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，進(jìn)行半定量RT-PCR，檢測鯉魚FcRγ在不同組織中的表達(dá)量，其中在鰓、脾、腎、等免疫相關(guān)組織中

6、含量最大，肝臟和腸中次之，皮膚中的表達(dá)量較低，肌肉中未檢測到表達(dá)。采用鰻弧菌肌肉注射免疫鯉魚1、2、3、4周，Real-timePCR檢測表明FcRγ基因mRNA表達(dá)水平在鰓、腎、腸、脾中均呈現(xiàn)一定規(guī)律的變化，在免疫誘導(dǎo)后表達(dá)量先升高后下調(diào)，整體趨勢符合機(jī)體受刺激后免疫球蛋白的產(chǎn)生規(guī)律，揭示FcRγ在鯉魚免疫中發(fā)揮著重要的作用；采用鰻弧菌浸泡免疫鯉魚0-7天，Real-timePCR檢測表明在鰓組織中FcRγ基因mRNA表達(dá)呈升高趨勢，

7、在浸泡刺激后0.5-5天內(nèi)表達(dá)量持續(xù)升高，第7天略有下降，結(jié)果表明FcRγ參與機(jī)體的天然免疫應(yīng)答，在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮著重要的作用。 (3)采用基因免疫的方法制備抗血清，利用得到的抗血清進(jìn)行瓊脂雙向擴(kuò)散以及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。測得抗血清的效價(jià)為1：4，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，在PVDF膜上顯示出了分子量約為10kDa的特異條帶。免疫組織化學(xué)定位結(jié)果顯示FcRγ廣泛分布于鯉魚的腸、脾等免疫相關(guān)組織。 綜上所述，克隆了鯉魚的FcR