基因轉錄激活子MeCP2和Rb調控環(huán)沉默在氫醌誘發(fā)細胞惡變過程中的作用及表觀遺傳學機制.pdf

1、研究背景:
　　DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學修飾(epigenetic modification)在基因轉錄調節(jié)過程起著重要作用，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的分子事件，是近年來生命科學的熱門研究領域之一，其中DNA甲基化是研究得最為廣泛的表觀遺傳學修飾。
　　MeCP2(methyl-CpG binding protein2)是MBD家族最重要的成員之一，也是潛在的腫瘤臨床治療靶點。大量研究表明，MeCP2是一個多功能

2、基因，而這些功能絕大多數(shù)是通過對其他基因的轉錄調節(jié)而實現(xiàn)的。
　　苯是一種常見的環(huán)境污染物和重要的工業(yè)溶劑，是一種全球用量極大的環(huán)境致癌物，其過量暴露和急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）發(fā)病風險升高有關。氫醌（hydroquinone，HQ）是苯的重要代謝產(chǎn)物，是一種具有血液毒性的毒物，長期、過量暴露于HQ能引起貧血、白血病等血液疾病，由于不需活化即有生物學活性，是苯的常用體外研究替代物。Me

3、CP2表達異常在各種腫瘤組織和細胞中非常常見，且普遍為高表達。國內外而關于毒物對MeCP2表達的影響研究非常少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，MeCP2表達在HQ處理細胞、HQ誘導惡性轉化細胞中呈現(xiàn)出動態(tài)變化，且Rb表達與MeCP2的表達在不同時間點的相關關系一直保持不變，提示Rb很有可能受MeCP2的正性調節(jié)。
　　Rb基因(retinoblastoma gene)是腫瘤臨床治療靶點，Rb的功能涉及細胞凋亡和衰老、細胞增殖、細胞周期、應對D

4、NA損傷和維持基因組穩(wěn)定，同時研究表明，Rb表達異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程也起非常重要的作用，但其異常表達的機制尚不清晰。
　　綜上，前期研究結果、生物信息學分析結果和前人關于Rb和MeCP2功能研究結果，我們提出假設:HQ誘發(fā)的癌變過程中，MeCP2與Rb之間很可能存在正調控環(huán)，該調控環(huán)使MeCP2和Rb在HQ誘導的癌變進程中，表達量越來越低以致其沉默，其中表觀遺傳學改變在此過程發(fā)揮重要作用。為證實該假設開展了本研究。
　　

5、研究方法:
　　1.細胞及HQ劑量選擇
　　使用TK6淋巴母細胞進行本研究，遵循兩個原則:(1)細胞染毒后能觀察到HQ對細胞有一定的毒性，但細胞活力不能小于75％;(2)我國涉苯行業(yè)苯的實際接觸水平。
　　2.細胞生物學性狀檢測
　　以細胞計數(shù)法和CCK-8試劑盒檢測惡性轉化細胞的生長速度。細胞固定后，以PI標記，用流式細胞術檢測細胞周期分布情況。使用PI和FITC的雙標記法進行細胞標記，流式細胞術對細胞的凋亡情

6、況進行分析。
　　3.化學物處理
　　使用DNMT甲基轉移酶抑制劑(5-AZA)、組蛋白乙?；敢种苿?TSA)或DNA損傷誘導劑DOX處理細胞，24 h后收集細胞并進行相關檢測。
　　4.基因表達水平檢測
　　使用TRIzol試劑提取細胞RNA，進行反轉錄，用SYBR Green定量RT-PCR檢測細胞mRNA表達水平。使用細胞裂解液裂解細胞并提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，Western blotting檢

7、測相關蛋白表達水平。細胞用甲醇固定后，使用間接免疫熒光流式細胞術檢測Rb和MeCP2蛋白表達。
　　5.甲基化特異性PCR檢測基因啟動子DNA甲基化水平
　　在UCSC數(shù)據(jù)庫調取基因啟動子DNA序列，使用methyl primer express甲基化特異性PCR引物設計軟件設計引物。使用試劑盒提取細胞基因組DNA后，使用基因組DNA進行CpG修飾。使用PCR方法檢測啟動子區(qū)DNA甲基化水平。
　　6.生物信息學分析<

8、br>　　從UCSC調取Rb啟動子區(qū)DNA序列，查閱相關文獻并使用consite等軟件預測MeCP2結合位點。
　　7.染色質免疫共沉淀（ChIP）檢測啟動子區(qū)蛋白結合情況
　　設計PCR引物，細胞使用1％甲醛交聯(lián)后，提取細胞核，超聲和核酶處理細胞核。使用chip級別抗體進行染色質沉淀，對染色質進行純化，使用實時熒光定量PCR方法對沉淀染色質含量進行檢查。
　　8.慢病毒MeCP2表達載體構建及穩(wěn)定表達細胞構建

9、　　使用基因克隆的方法將MeCP2的CDS克隆至Plvx-puro真核表達載體，使用慢病毒進行包裝并感染細胞，感染后的細胞使用嘌呤霉素進行篩選，獲得穩(wěn)定表達細胞后用Western blotting對MeCP2表達量進行鑒定。
　　9.Co-IP檢測MeCP2/Rb蛋白復合體
　　RIPA裂解液裂解細胞后，調整蛋白濃度使每個樣品蛋白濃度一致，按500μg/μg抗體加入抗體，4℃搖床過夜，加入瓊脂糖珠，4℃搖床1h，收集上清，使

10、用細胞裂解液洗滌3次，加入SDS上樣緩沖液，沸水浴變性5min，進行westernblotting檢測。
　　研究結果
　　1.染毒劑量的選擇
　　HQ劑量選擇遵循以下兩個原則:(1)細胞染毒后能觀察到HQ對細胞有一定的毒性，但細胞活力不能小于75％;(2)我國涉苯行業(yè)苯的實際接觸水平。因此HQ劑量選擇為0～20.0μmol/L。
　　2.惡性轉化細胞生長速度檢測結果表明，HQ處理細胞已經(jīng)初步具有腫瘤惡性特征。<

11、br>　　3.惡性轉化細胞周期和凋亡改變
　　惡性轉化細胞S期細胞比例比正常細胞增多，由正常細胞的41.1％上升為48.2％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.RB、PTEN、p53、TPOR、H-RAS和miR-223在惡性轉化細胞中的表達
　　RT-PCR方法檢測Rb、PTEN、p53、TPOR和H-RAS五個基因的mRNA及miR-223的表達水平，與正常細胞相比，Rb和PTEN的mRNA表達量在惡性轉

12、化細胞中的表達水平下降，分別是正常細胞的0.61和0.49倍，而TPOR、H-RAS和miR-223的表達水上升，分別為為正常細胞的1.91、1.73和2.36倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而p53基因mRNA表達量無明顯改變。western blotting結果顯示，Rb、PTEN、TPOR和H-RAS基因的表達水平與RT-PCR的結果相一致，但是P53蛋白的表達量比正常細胞低。
　　5.TSA和5-AZA處理對惡性轉

13、化細胞Rb和TPOR表達水平的影響
　　DNMT抑制劑5-AZA和去乙?；福℉DAC）抑制劑TSA處理惡性轉化細胞，5-AZA可使Rb基因的mRNA表達水平恢復至正常，對p53和PTEN基因的mRNA表達沒有影響，然而可使TPOR的mRNA表達水平較惡性轉化細胞的上升得更高。
　　6.TSA和5-AZA處理對惡性轉化細胞生物學性狀的影響
　　5-AZA和TSA處理均可降低惡性轉化細胞的細胞活力，其細胞活力分別是未處理

14、組的49.1％和43.1％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同時細胞周期阻滯于G1期，5-AZA和TSA處理細胞G1比例分別由對照組的37.5％上升到60.8％(P＜0.05)和70.3％(P＜0.05)，細胞凋亡率也顯著提高，分別由對照組的10.4％上升到23.8％(P＜0.05)和15.1％(P＜0.05)。
　　7.RB、DNMTs、MBDs在HQ處理細胞和HQ惡性轉化細胞中的動態(tài)表達
　　只有MeCP2表達趨勢和R

15、b的表達趨勢保持一致，為正相關關系。
　　8.MeCP2調節(jié)Rb生物信息學預測
　　經(jīng)分析在Rb啟動子區(qū)有兩個CpG島，在CpG島內有25個MeCP2特異性結合位點，兩個MBD2結合位點。
　　9.Rb啟動子區(qū)DNA甲基化及MECP2結合情況檢測
　　提取用HQ處理5w并脫離處理10天的細胞DNA進行MSP檢測，結果表明，Rb啟動子區(qū)DNA甲基化程度先隨著HQ劑量的增加而降低，而后又上升。
　　10.TSA

16、和5-AZA處理對MeCP2和MBD2表達水平的影響
　　5-AZA和TSA處理能恢復HQ惡性轉化細胞的MeCP2表達水平，與HQ惡性轉化細胞相比，表達水平上升，而MBD2的表達水平經(jīng)TSA處理后下降，5-AZA處理無顯著性影響。
　　11.Rb蛋白與MeCP2蛋白形成蛋白復合體
　　CO-IP結果表明，Rb蛋白和MeCP2蛋白之間能形成蛋白復合體。
　　12.MeCP2基因恢復對惡性轉化細胞Rb基因表達的恢復<

17、br>　　與GFP空載體細胞相比，MeCP2表達載體細胞的MeCP2的mRNA表達水平上升6.25倍，western blotting檢測結果得到一致的結果。Rb的表達水平和MeCP2的相一致，表明MeCP2能激活Rb表達。
　　13.Rb調控MeCP2基因表達
　　DOX處理可激活惡性轉化細胞Rb蛋白的表達，同時伴有MeCP2蛋白表達的上升。
　　結論:
　　1.DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1

18、和MBD2在HQ處理的TK6細胞及其惡性轉化細胞中的表達出現(xiàn)異常，TPOR、H-RAS、PTEN、p53和miR-223在惡性轉化細胞中的表達也出現(xiàn)異常。
　　2.Rb和MeCP2表達在惡性轉化細胞中的表達為下調，在HQ處理的非惡性轉化細胞中的表達為上調，二者的表達始終保持相同趨勢。
　　3.MeCP2和Rb之間存在正調控環(huán)，該調控環(huán)的沉默在HQ誘發(fā)的腫瘤發(fā)生過程發(fā)揮重要的生物學作用。
　　4.表觀遺傳學機制在HQ介導