2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase,ANL)是一類廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品添加劑和洗滌劑添加劑等工業(yè)領(lǐng)域,具有良好生物安全性的生物催化劑。本論文以本課題組保藏的、分離自新疆火山口的脂肪酶高產(chǎn)菌株黑曲霉FJNU01菌株為出發(fā)材料,克隆其脂肪酶基因。通過比較黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)及其兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基序列與黑曲霉阿魏酸酯酶(A.niger feruloyl esterase,ANE)對應(yīng)區(qū)域的氨基酸殘基序列的差

2、異,確定突變位點(diǎn),構(gòu)建了一系列脂肪酶突變體。
   利用重疊延伸PCR方法,對黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)兩側(cè)鉸鏈區(qū)上的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變,獲得了anl-S84G、anl-D99P、anl-K108E三個(gè)突變脂肪酶基因;將組成脂肪酶整個(gè)α-螺旋蓋子結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基序列替換成阿魏酸酯酶對應(yīng)結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基序列,獲得了脂肪酶突變基因anl-anelid;將組成脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)左右兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基序列替換成阿魏酸酯酶對應(yīng)區(qū)域的氨基酸

3、殘基序列,獲得了脂肪酶突變基因anl-lidLR。
   將分子改造后的脂肪酶突變基因插入到pPIC9K質(zhì)粒中,構(gòu)建系列重組表達(dá)載體;重組表達(dá)載體經(jīng)SacⅠ線性化后導(dǎo)入到巴斯德畢赤酵母GS115,篩選得到重組轉(zhuǎn)化子。重組轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá),離心收集發(fā)酵上清液,然后用堿性滴定法測定重組脂肪酶突變體酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:GS-pPIC9K-anl-D99P和GS-pPIC9K-anl-K108E重組子發(fā)酵上清液的脂肪酶酶活分別為21

4、.37U/mL和16.30U/mL,相對野生型脂肪酶分別為85.48%和65.20%,而GS-pPIC9K-anl-S84G、GS-pPIC9K-anl-anelid和GS-pPIC9K-anl-lidLR的發(fā)酵上清液均未檢測到脂肪酶活性。用Ni-NTA純化上述發(fā)酵上清液中的重組蛋白,純化后的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果表明:ANL-S84G、ANL-D99P、ANL-K108E、ANL-anelid均顯示單一條帶,而anl-lidL

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