輻射誘發(fā)HL-7702細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性研究.pdf

1、目的：在細(xì)胞、基因和蛋白水平上檢測(cè)60Co－γ射線誘發(fā)人肝細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性，并用基因芯片和雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)探討其分子機(jī)制，篩選與輻射誘發(fā)基因組不穩(wěn)定性相關(guān)的基因和蛋白，為闡明輻射誘發(fā)基因組不穩(wěn)定性的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。
　　 方法：(1)采用60Co－γ射線照射人正常肝細(xì)胞7702(HL-7702)，照射劑量為OGy(對(duì)照組)、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy。檢測(cè)受照后7702細(xì)胞克隆存活率、微核形成率、單細(xì)胞

2、凝膠電泳(SCGE)、細(xì)胞凋亡率。(2)檢測(cè)各劑量點(diǎn)受照細(xì)胞子代的上述指標(biāo)。(3)對(duì)各劑量受照細(xì)胞克隆子代同時(shí)給予2Gy的二次照射，然后檢測(cè)克隆存活率、微核形成率、單細(xì)胞凝膠電泳、細(xì)胞凋亡率。(4)分別提取經(jīng)2、4、6Gyγ射線照射后子代細(xì)胞的總RNA，采用Illumina人全基因組基因芯片分析基因表達(dá)情況，并篩選出差異表達(dá)基因。(5)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)驗(yàn)證部分差異基因。(6)用GeneSpring GX10軟件對(duì)

3、差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建差異表達(dá)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。(7)提取受照射后子代細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行2-DE分離，考馬斯亮藍(lán)染色，差異表達(dá)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定分析結(jié)果。(8)用Western blot方法驗(yàn)證質(zhì)譜鑒定出的差異表達(dá)蛋白熱休克蛋白60(HSP60)和珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子1(GATA-1)在各劑量克隆子代中的表達(dá)。(9)用激光共聚焦顯微技術(shù)觀察差異表達(dá)蛋白HSP60、GATA-1和真核翻譯起

4、始因子5A(EIF5A)在各劑量克隆子代中的定位及表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)首次照射后，HL-7702細(xì)胞的克隆存活率、微核形成率、SCGE尾長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡率與照射劑量之間存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。(2)首次照射后各劑量組存活的克隆子代細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，克隆存活率、微核形成率、SCGE尾長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。(3)首次照射后各劑量組存活的克隆子代細(xì)胞經(jīng)2Gy的二次照射后，上述檢測(cè)結(jié)果與首次照射劑量之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系。(4)基因芯片

5、測(cè)定2Gy照射后子代細(xì)胞差異表達(dá)顯著的基因有262個(gè)；4Gy照射組有2746個(gè)差異表達(dá)基因；6Gy照射組有3406個(gè)差異表達(dá)基因；三個(gè)劑量組的共同差異表達(dá)基因有71個(gè)，其中上調(diào)基因35個(gè)，下調(diào)基因36個(gè)。這些基因的功能涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡、DNA結(jié)合、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、DNA復(fù)制和修復(fù)等。利用生物信息學(xué)分析軟件構(gòu)建了差異表達(dá)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖并分析了RAN、CDT1、IER3、V-FOS等基因的生物學(xué)功能。(5)受照

6、射7702細(xì)胞克隆子代細(xì)胞雙向電泳圖譜與對(duì)照組相比，共發(fā)現(xiàn)差異蛋白點(diǎn)42個(gè)，其中10個(gè)上調(diào)蛋白，32個(gè)下調(diào)蛋白。經(jīng)質(zhì)譜分析，成功鑒定出17個(gè)差異表達(dá)蛋白，這些差異蛋白包括翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)、熱休克蛋白27(HSP27)、熱休克蛋白60(HSP60)、珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子1(GATA-1)、巰基特異性抗氧化酶(TSA)、氯離子通道蛋白1(CLICI)、真核翻譯起始因子(EIFlA，EIF5A)、真核翻譯延長(zhǎng)因子1(EEFlA)等。(6

7、)Western blot分析結(jié)果表明HSP60和GATA-1表達(dá)與受照劑量的關(guān)系與2-DE結(jié)果一致。(7)激光共聚焦結(jié)果顯示HSP60與EIF5A蛋白在細(xì)胞中表達(dá)豐富，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞核的周圍。熒光定量分析結(jié)果與雙向電泳分析結(jié)果一致：
　　 結(jié)論：(1)電離輻射誘發(fā)的基因組不穩(wěn)定性可傳遞給受照細(xì)胞的后代，并在細(xì)胞復(fù)制多代后仍以潛在的方式存在于子代中，從而表現(xiàn)出滯后的遺傳學(xué)效應(yīng)?；蚪M不穩(wěn)定性的發(fā)生與DNA的首次損傷事件之

8、間存在明顯的相關(guān)關(guān)系。(2)二次事件的放大作用在基因組不穩(wěn)定性的傳遞過程中起著重要的作用。二次損傷放大了處于不穩(wěn)定狀態(tài)的基因組損傷，使其更容易被檢測(cè)，因而可作為研究基因組不穩(wěn)定性的有效工具。(3)電離輻射可誘發(fā)HL-7702子代細(xì)胞中一系列基因與蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，提示基因組不穩(wěn)定性涉及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。其中，RAN、CDT1、IER3、RAD51AP1、HAVCR2基因及HSP60、GATA-1蛋白在受照肝細(xì)胞子代中均顯示出特征性的差異表