多殺菌素高產(chǎn)菌株的理性化選育和發(fā)酵工藝的優(yōu)化研究.pdf

1、新型廣譜生物殺蟲劑多殺菌素是由刺糖多孢菌經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的兩種最高活性次級代謝物spinosyn A和spinosyn D組成的混合物。多殺菌素殺蟲譜廣，具有以下特性：作用方式獨(dú)特，對害蟲活性高，半衰期短，低殘留，無抗藥性，對人畜無害，環(huán)境污染少等。多殺菌素在農(nóng)牧業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景，該產(chǎn)品的開發(fā)具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。本文首先對多殺菌素HPLC檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，然后進(jìn)行刺糖多孢菌高產(chǎn)菌株的理性化選育，獲得高產(chǎn)菌株后進(jìn)而對刺糖多孢菌

2、的搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，最后還進(jìn)行了多殺菌素的生理毒性試驗(yàn)。 首先對多殺菌素HPLC檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，建立起多殺菌素的快速檢測方法。優(yōu)化后的HPLC檢測條件如下：色譜柱采用Agilent Zorbax XDB-C18柱；流動相為66.7％甲醇+33.3％乙腈；流速1.0 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫25.0℃；進(jìn)樣量20μL。該條件下多殺菌素二組分spinosyn A和spinosyn D的保留時間分別為5.24 m

3、in和5.74 min，比優(yōu)化前HPLC條件下的保留時間分別縮短了55.3％和59.1％。HPLC檢測方法線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R=0.9999；同時該方法具有較高的精確度和準(zhǔn)確度，其變異系數(shù)為0.17％，平均回收率為100.21％。 根據(jù)多殺菌素的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理，對刺糖多孢菌進(jìn)行理性化選育。本文采用UV結(jié)合LiCl以及DES結(jié)合LiCl兩種常規(guī)誘變方法對刺糖多孢菌進(jìn)行復(fù)合誘變，分別篩選鼠李糖抗性突變株、2-脫氧-

4、D-葡萄糖抗性突變株和多殺菌素抗性突變株，并結(jié)合自然分離純化，最終獲得高產(chǎn)菌株S-6032，其產(chǎn)量達(dá)到89.57 mg/L，較出發(fā)菌株(產(chǎn)量為38.03 mg/L，)提高了135.5％。 以S-6032為出發(fā)菌株，對刺糖多孢菌的搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過一系列單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，最終確定最佳搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖50.0 g/L，麥芽糖10.0 g/L，棉籽蛋白20.0 g/L，硫酸銨1.0 g/L，硫酸鋅0.2 g/L，玉

5、米漿15.0 g/L，牛肉膏2.0 g/L，碳酸鈣5.0 g/L；確定搖瓶培養(yǎng)最佳接種量為10％，最佳裝液量為30 mL/250 mL搖瓶，最佳培養(yǎng)基初始pH為7.5。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下對S-6032進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，最終產(chǎn)量為117.83 mg/L，較優(yōu)化前發(fā)酵培養(yǎng)條件下所得產(chǎn)量(89.57 mg/L)提高了31.6％。 最后進(jìn)行多殺菌素生理毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明多殺菌素對斜紋夜蛾幼蟲毒殺效果顯著。發(fā)酵液提取多殺菌素樣品(約1 00