分子伴侶和融合標(biāo)簽改善TEV蛋白酶折疊的效應(yīng).pdf

1、同義突變所引起的蛋白質(zhì)折疊受損正逐漸成為人們研究的熱點，人類部分基因因同義突變而罹患疾病，因此改善同義突變帶來的折疊損傷至關(guān)重要。在大腸桿菌中通過同義突變提高異源蛋白表達水平的同時，也會降低特定蛋白的折疊，如煙草蝕斑病毒蛋白酶( Tobacco etch virus protease，TEVp)。有關(guān)改善密碼子突變體蛋白折疊的研究未見報道。為此，我們以大腸桿菌表達系統(tǒng)為模型，研究共表達分子伴侶或者融合標(biāo)簽對不同TEVp突變體蛋白折疊的影

2、響，獲得以下結(jié)果：
　　1.定性和定量分析了共表達分子伴侶組A（ GroEL、GroES和GrpE）或組B（ DnaK、DnaJ和ClpB）對6種TEVp突變體（4種氨基酸突變體，2種同義突變體）表達水平的影響。16℃誘導(dǎo)24 h后，共表達分子伴侶組B改善TEVp突變體表達水平要高于分子伴侶組A，表明低溫條件下不同分子伴侶在改善同義突變體蛋白折疊時的水平存在差異。
　　2.定性和定量分析了熱激條件下，分子伴侶對靶蛋白的折疊效

3、應(yīng)，37℃誘導(dǎo)4 h后，共表達分子伴侶組 A改善對 TEVp突變體表達水平要高于分子伴侶組 B，表明在高溫脅迫下只有特定的分子伴侶組對改善同義突變體蛋白折疊有作用。
　　3.分析了兩種標(biāo)簽及TEVp識別序列對6種TEVp突變體的的表達水平影響：重組表達的細(xì)胞的粗酶液上清液中，SDS-PAGE檢測到了明顯 MBP融合的 TEVp氨基酸突變體特異條帶；而含有TEVp識別序列的融合蛋白由胞內(nèi)自剪切產(chǎn)生的無標(biāo)簽TEVp突變體條帶不明顯；T

4、rx標(biāo)簽對TEVp的表達水平?jīng)]有明顯改善作用。
　　4.分析了兩種標(biāo)簽和TEVp識別序列對6種TEVp突變體酶學(xué)活性影響。和前期研究結(jié)果相比，MBP提高TEVp氨基酸突變體的水溶性和活性，但是對同義突變體的活性沒有明顯作用，插入的識別序列近一步提高TEVp氨基酸突變體活性，但是對同義突變體沒有明顯作用。Trx標(biāo)簽對 TEVp氨基酸突變體的水溶性沒有較大改善但可提高其活性，但對同義突變體活性沒有提升，插入的TEVp識別序列也沒有明顯

5、提升兩類突變體活性的作用。
　　5.分析了提高胞內(nèi)稀有tRNA水平對融合的TEVp突變體表達和酶學(xué)活性的影響。在RosettaTM（DE3）中，融合MBP和Trx標(biāo)簽的TEVp氨基酸突變的活性要比在BL21（DE3）中表達時高，Trx標(biāo)簽對氨基酸突變體的活性提升水平要比MBP標(biāo)簽高；而融合兩種標(biāo)簽的TEVp同義突變體的活性相比在BL21（DE3）表達時沒有明顯的改善。
　　綜上所述，本實驗證明在不同溫度脅迫下，不同類型的分子