HDAC2自身磷酸化對其SUMO E3連接酶活性的作用及機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HDACs)是一類鋅離子依賴性金屬蛋白酶，此酶活性結(jié)構(gòu)域位于蛋白的N末端，介導(dǎo)組蛋白或非組蛋白的去乙?；揎?，特別是對核小體組蛋白去除乙?；揎棧芍氯旧w凝聚而改變核小體結(jié)構(gòu)，強力阻礙靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，發(fā)揮靶基因轉(zhuǎn)錄沉默作用，特別是對抑癌基因、凋亡基因和分化基因的轉(zhuǎn)錄具有明顯的抑制作用，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤，被公認(rèn)為有效的抗癌靶點。目前共發(fā)現(xiàn)18種HDACs，

2、按結(jié)構(gòu)和功能可分為四大類，其中Ⅰ類包括HDAC1、2、3和8，其廣泛表達(dá)于各種真核細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞的增殖、生長、凋亡和分化等發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　其中HDAC2高表達(dá)于結(jié)直腸癌和肺癌等多種腫瘤中，其表達(dá)高低與腫瘤的預(yù)后明顯相關(guān)，抑制HDAC2的活性或表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和生長，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。然而，研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)應(yīng)用去乙酰化酶抑制劑后，可誘發(fā)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)直腸癌和肺癌細(xì)胞產(chǎn)生獲得

3、性耐藥，但其耐藥機制仍不清楚。但若將HDAC抑制劑與mTOR通路抑制劑sirolimus聯(lián)合應(yīng)用，則能協(xié)同增強HDAC抑制劑對結(jié)直腸癌的殺瘤效應(yīng)。由此提示HDAC2在結(jié)直腸癌和肺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥中起重要作用，但其作用機制仍不清楚。
　　另外，我們前期研究還發(fā)現(xiàn)，HDAC2除具有去乙?；福苯酉抡{(diào)核小體組蛋白的乙?；揎棧聊琾53、p21、Bax和NOXA等抗細(xì)胞增殖和促凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，或者直接去除這些蛋白乙酰化修

4、飾，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用外;其還具有SUMO E3連接酶活性，且通過此功能介導(dǎo)，其可上調(diào)翻譯起始因子eIF4E的SUMO化修飾，激活帽依賴性mRNA的翻譯，上調(diào)促細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡相關(guān)基因如ODC、C-myc、Survivin和Bcl-2的表達(dá)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
　　然而，盡管我們發(fā)現(xiàn)并證實HDAC2具有SUMO E3連接酶新功能，且證實此新功能可通過調(diào)節(jié)真核翻譯起始因子eIF4E的SU

5、MO化修飾，而激活帽依賴性mRNA的翻譯，但HDAC2的SUMO E3連接酶新功能的生物學(xué)意義仍不清楚，特別是此新功能如何協(xié)同其去乙酰化酶活性，通過轉(zhuǎn)錄沉默和翻譯激活而選擇性調(diào)控有利于腫瘤發(fā)生、增殖、生長和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，在結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥中發(fā)揮重要作用的機制仍不得而知。并提示，單純阻斷HDAC2的去乙?；富钚詫δ[瘤的治療存在缺陷，這也可能是腫瘤耐藥的主要原因。為此我們認(rèn)為HDAC2雙酶活性協(xié)同抑制策略可能對腫瘤的

6、治療具有更好的療效。然而，目前所有靶向HDAC2的抗腫瘤藥物均是針對去乙?；富钚远O(shè)計，而針對SUMO E3連接酶的抑制劑仍待研發(fā)。而要設(shè)計研發(fā)靶向HDAC2 SUMO E3連接酶活性的抑制劑，我們首先必須了解此酶的活化調(diào)控機制。
　　HDACs的活性受到多種機制的調(diào)控，包括翻譯后修飾、亞細(xì)胞定位和輔阻遏蛋白質(zhì)復(fù)合物相互作用。其中，翻譯后修飾不僅直接影響HDACs的活性，而且影響其亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)復(fù)合物相互作用，從而間接調(diào)控其

7、轉(zhuǎn)錄抑制活性。翻譯后修飾方式主要包括磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO化等，其中磷酸化是HDAC2的主要翻譯后修飾方式，存在于羧基端的S394、S407、S411、S422和S424等5個絲氨酸位點可被磷酸化修飾。另外，分析發(fā)現(xiàn)HDAC2的磷酸化修飾區(qū)域正好位于其SUMO E3連接酶的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，且磷酸化修飾和SUMO修飾之間存在密切的聯(lián)系。為此，我們推測HDAC2的自身磷酸化在其SUMO E3連接酶功能的發(fā)揮中起重要的調(diào)節(jié)作用，但有待證實

8、。
　　在體內(nèi)磷酸化修飾HDAC2的激酶主要是CKⅡ，CKⅡ也可在體內(nèi)外介導(dǎo)HDAC2394、422和424位絲氨酸的磷酸化修飾[31]。與此相一致，CKⅡ也可介導(dǎo)HDAC1的磷酸化修飾，且突變HDAC1磷酸化位點S421A、S423A而消除其磷酸化修飾，反而促進(jìn)HDAC1的SUMO化修飾。由此提示，CKⅡ介導(dǎo)的HDAC2自身磷酸化修飾也可能與其自身SUMO化修飾之間存在必然的聯(lián)系，而HDAC2自身SUMO化修飾是其發(fā)揮SUMO

9、E3連接酶活性的基礎(chǔ)。然而，關(guān)于CK2介導(dǎo)的HDAC2磷酸化修飾對其自身SUMO E3連接酶活性的調(diào)控作用還未見報道。
　　為此，本研究將主要采用基因點突變技術(shù)，初步探討HDAC2自身磷酸化對其SUMOE3連接酶的影響和作用，并明確磷酸化修飾對HDAC2 SUMO E3連接酶的調(diào)節(jié)機制，為進(jìn)一步設(shè)計研發(fā)靶向抑制HDAC2 SUMO E3連接酶活性的抗癌新藥奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　本研究將首先通過基因點突變和片段缺失

10、突變技術(shù)，構(gòu)建HDAC2已知磷酸化位點S394A、S407A、S411A、S422A和S424A的磷酸化位點突變體和片段缺失突變體，后應(yīng)用反應(yīng)HDAC2 SUMO E3連接酶活性報告基因?qū)嶒炶b定直接去除這些位點磷酸化對其活性的影響和作用;其次再應(yīng)用CK2激酶的抑制劑四溴苯并三唑(TBB)，阻斷CK2的活性，證實間接減弱HDAC2的自身磷酸化修飾對HDAC2 SUMO E3連接酶活性的影響和作用;第三，在上述基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)分析HD

11、AC2是否存在新的磷酸化修飾位點，后進(jìn)一步構(gòu)建HDAC2新磷酸化位點的突變體，后再應(yīng)用研究報告基因?qū)嶒?、Western-blot實驗和細(xì)胞增殖實驗等探討HDAC2特定位點的磷酸化修飾對其SUMO E3連接酶活性的影響、機制和生物學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了HDAC2的已知磷酸化區(qū)域缺失及五個磷酸化位點的負(fù)性突變體的真核表達(dá)載體。
　　2.報告基因?qū)嶒炞C實，HDAC2的已知磷酸化區(qū)域缺失突變不影響其SUMO

12、E3連接酶活性，HDAC2的五個已知絲氨酸的磷酸化對其SUMO E3連接酶的活性也不起調(diào)節(jié)作用。
　　3.CK2的抑制劑四溴苯并三唑(TBB)能抑制CK2介導(dǎo)的HDAC2的自身磷酸化修飾，且此抑制劑對HDAC2介導(dǎo)的帽依賴性翻譯報告基因LUC的表達(dá)起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。
　　4.生物信息學(xué)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)HDAC2的T477和T480位點是兩個潛在的自身磷酸化位點，且與野生型相比，T477此位點的磷酸化負(fù)性突變體顯著增加HDAC2的S

13、UMO E3連接酶反應(yīng)性報告基因的表達(dá)，是野生型的4.24倍，由此提示此位點的磷酸化修飾負(fù)性調(diào)節(jié)HDAC2的SUMO E3連接酶活性。
　　5.IP、western blot和細(xì)胞增殖實驗證實，HDAC2 T477A的磷酸化負(fù)性突變體顯著增加HDAC2的自身SUMO化和eIF4E的SUMO化修飾，在翻譯水平增強eIF4E調(diào)控的靶蛋白（如Bcl-2、cyclin D1、C-myc、Survivin和ODC等）翻譯的增加，并促進(jìn)結(jié)腸細(xì)

14、胞的增殖。
　　結(jié)論:
　　HDAC2的自身磷酸化參與了其SUMO E3連接酶活性的調(diào)節(jié)，此調(diào)節(jié)機制與HDAC2的T477位點的磷酸化相關(guān)，而與S394、S407、S411、S422和S424五個位點的磷酸化無關(guān)。同時，HDAC2 T477的磷酸化對其SUMO E3連接酶的的活性調(diào)節(jié)為負(fù)性調(diào)節(jié)，即HDAC2 T477A的突變體能顯著增強HDAC2自身SUMO化修飾、eIF4E的SUMO化修飾，以及在翻譯水平提高eIF4E介導(dǎo)