六個(gè)miniSTR基因座群體遺傳學(xué)研究.pdf

1、目的：短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，由于在人類基因組中分布廣泛，具有高度的遺傳多態(tài)性以及簡單快捷的檢測方法，已成為法醫(yī)物證鑒定的主流技術(shù)。然而，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中經(jīng)常會面臨高度降解的檢材，如使用商品化STR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，片段較大的STR基因座往往無法得到正確的分型或是分型失敗。miniSTR基因座分析技術(shù)即是在設(shè)計(jì)引物時(shí)，使其盡可能靠近核心重復(fù)序列從而縮短擴(kuò)增片段長度，以提高檢測的靈敏度及

2、降解片段的檢出率。miniSTR基因座已被歐洲D(zhuǎn)NA分型工作組（the european DNA profiling group，EDNAP）定義為繼STR之后的新一代遺傳標(biāo)記，2006年美國AB公司已經(jīng)研制開發(fā)了MiniFiler試劑盒。miniSTR，miniX-STR，miniY-STR的研究已顯示了其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要價(jià)值。miniSTR應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)時(shí)，進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、方便的分型檢測顯得至關(guān)重要，因此對其分型結(jié)果的準(zhǔn)確性、公正性

3、和可靠性提出了更高的要求。而等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物（allelic ladder，簡稱AL）的制備又是實(shí)現(xiàn)基因座準(zhǔn)確分型命名的關(guān)鍵。只有具備了一套精確的、國際標(biāo)準(zhǔn)化命名的分型標(biāo)準(zhǔn)物，才有可能對miniSTR分型結(jié)果做出正確判型和命名，才有可能在各國、各實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)現(xiàn)miniSTR分型的可比性。為研究更多的miniSTR基因座用于法醫(yī)學(xué)鑒定，解決一些疑難檢材的DNA分型，本課題擬采用分子克隆技術(shù)制備六個(gè)miniSTR基因座D10S1248、D

4、2S441、D1S1677、D9S1122、D10S1435和D17S1301等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，解決miniSTR分型的準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)化問題，并應(yīng)用于湖南漢族群體遺傳學(xué)研究中，探討該方法制備的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物在法庭科學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：采用Chelex-100法提取155份湖南漢族無關(guān)健康個(gè)體全血基因組DNA。采用PCR擴(kuò)增，10％變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，銀染顯色，在所選樣本中篩選、分離六個(gè)miniSTR基因

5、座所有目的等位基因，用Promega公司凝膠回收試劑盒純化后，將其分別插入到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)染DH5αTM感受態(tài)大腸桿菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，4％瓊脂糖凝膠電泳初步篩選陽性克隆，測序證實(shí)連接正確目的等位基因的核心序列結(jié)構(gòu)和重復(fù)次數(shù)，并按照國際法庭血液遺傳學(xué)學(xué)會（international society of forensic haemogenetics，ISFH）推薦的命名原則對各等位基因命名；提取重組質(zhì)粒，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)

6、瓊脂糖檢測的顯色強(qiáng)度或GeneQuant微量蛋白核酸檢測儀對擴(kuò)增產(chǎn)物的定量結(jié)果，調(diào)整各成分的比例，使峰高盡可能達(dá)到平衡，混合各等位基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即獲得各miniSTR基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。
　　 應(yīng)用自制miniSTR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行所選樣本的群體遺傳學(xué)研究：將基因座D10S1248和D17S1301上游引物5’端用6-FAM熒光標(biāo)記，基因座D2S441和D9S1122上游引物5’端用HEX熒光標(biāo)記，基因