血漿miRNA與腰椎間盤(pán)退變的相關(guān)性及補(bǔ)腎壯督方的干預(yù)研究.pdf

1、目的:
　　1.篩選腰椎間盤(pán)退變(Lumbar intervertebral disc degeneration，LIDD)患者血漿中差異性表達(dá)的miRNA，探討差異性血漿miRNA是否在LIDD人群中具有特異性表達(dá)，是否對(duì)LIDD診斷有價(jià)值。
　　2.建立大鼠LIDD的動(dòng)物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證差異性miRNA的表達(dá)與LIDD的關(guān)系，并檢測(cè)椎間盤(pán)中差異性miRNA靶基因介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)變化。
　　3.通過(guò)補(bǔ)腎壯督方

2、干預(yù)LIDD大鼠，探討補(bǔ)腎壯督方對(duì)差異性miRNA及其靶基因介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)影響，進(jìn)一步揭示補(bǔ)腎壯督方延緩LIDD的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.臨床研究
　?、龠x取2015年12月-2016年4月就診于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院脊柱科住院部及門(mén)診的3例LIDD患者作為病例組，同期選取3例年齡和性別相匹配且無(wú)LIDD的志愿者作為對(duì)照組。抽取LIDD患者和無(wú)LIDD志愿者的血漿，進(jìn)行MicroRNA芯片的篩選。

3、
　?、谕ㄟ^(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對(duì)MicroRNA芯片篩選出差異表達(dá)明顯的miRNA進(jìn)行原位驗(yàn)證，選出與LIDD密切相關(guān)的差異表達(dá)miRNA。
　?、凼占?015年12月-2016年8月就診于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院脊柱科住院部及門(mén)診的30例LIDD患者作為病例組，同期選取20例年齡和性別相匹配且無(wú)LIDD的志愿者作為對(duì)照組。根據(jù)原位驗(yàn)證的結(jié)果，以及文獻(xiàn)報(bào)道研究，將與LIDD密切相關(guān)的miRNA在這50例人群中進(jìn)行擴(kuò)大

4、樣本驗(yàn)證研究，進(jìn)一步驗(yàn)證差異miRNA表達(dá)與LIDD的特異性。并對(duì)有差異性的miRNA進(jìn)行受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC曲線(xiàn)）分析，使用ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)評(píng)估它們的診斷價(jià)值。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究
　　選取60只雄性SD大鼠（3月齡），隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組，每組各12只。假手術(shù)組:從大鼠的腹部右側(cè)旁正中切開(kāi)，暴露L4到L6椎間盤(pán)后即縫合皮膚。其他組:從大鼠的腹部右側(cè)旁正中切開(kāi)后，

5、暴露L4到L6椎間盤(pán)，并采用纖維環(huán)的全層穿刺法建立大鼠LIDD模型。造模第2天，低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組分別給予低劑量、中劑量和高劑量的補(bǔ)腎壯督方水煎液灌胃，假手術(shù)組和模型組則分別予等容積的生理鹽水灌胃。8周后，取大鼠的血漿和L4到L6的椎間盤(pán)。用HE染色觀察各組椎間盤(pán)的退變情況，并根據(jù)其退變程度進(jìn)行病理評(píng)分，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)血漿和腰椎間盤(pán)中的特異性miRNA的表達(dá)，采用蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-P

6、CR分析腰椎間盤(pán)中特異性miRNA靶基因及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.臨床研究
　　①miRNA芯片篩選出LIDD人群中存在23個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中7個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，16個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)。
　?、诟鶕?jù)MicroRNA芯片結(jié)果，對(duì)17個(gè)差異表達(dá)穩(wěn)定的miRNA進(jìn)行了原位驗(yàn)證，只有miRNA-4763-3p和miRNA-4767的下調(diào)表達(dá)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05

7、）。
　?、劢Y(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道研究，將miRNA-4763-3p、miRNA-4767和miRNA-125a-5p進(jìn)行了擴(kuò)大樣本驗(yàn)證研究。miRNA-4767和miRNA-125a-5p的表達(dá)顯著下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miRNA-4763-3p的表達(dá)下調(diào)則不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　?、躌OC曲線(xiàn)分析顯示，miRNA-4767和miRNA-125a-5p是對(duì)LIDD診斷有價(jià)值的生物標(biāo)記物（P＜0.05

8、）。其中miRNA-4767 AUC值為0.735，95％置信區(qū)間CI為:0.591-0.850;miRNA-125a-5p的AUC值為0.863，95％置信區(qū)間CI為:0.759-0.967。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究
　?、俑鹘M腰椎間盤(pán)HE染色的形態(tài)學(xué)改變
　　與假手術(shù)組比較，模型組的腰椎間盤(pán)發(fā)生了明顯的退變，組織退變?cè)u(píng)分顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量中藥組的腰椎間盤(pán)退變均出

9、現(xiàn)了明顯改善，組織學(xué)退變的評(píng)分均顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);補(bǔ)腎壯督方三個(gè)中藥組之間的組織學(xué)退變?cè)u(píng)分比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　?、诟鹘M血漿中miRNA-125a-5p的表達(dá)變化
　　與假手術(shù)組比較，模型組血漿中miRNA-125a-5p的表達(dá)降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);與模型組相比，低、中、高劑量中藥組血漿中miRNA-125a-5p的表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;補(bǔ)腎壯督

10、方的三個(gè)中藥組血漿中miRNA-125a-5p之間的表達(dá)比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　③各組腰椎間盤(pán)組織中miRNA-125a-5p的表達(dá)變化
　　與假手術(shù)組比較，模型組椎間盤(pán)組織中的miRNA-125a-5p表達(dá)明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;與模型組相比，低、中、高劑量中藥組椎間盤(pán)組織中的miRNA-125a-5p表達(dá)則明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;補(bǔ)腎壯督方的三個(gè)中藥組椎間盤(pán)組織中的mi

11、RNA-125a-5p表達(dá)之間比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　④各組miRNA-125a-5p靶基因TP53INP1及p21、Caspase-3的基因表達(dá)變化
　　與假手術(shù)組比較，模型組的TP53INP1、p21和caspase-3基因表達(dá)都明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;與模型組相比，低、中、高劑量中藥組的TP53INP1、p21和caspase-3基因表達(dá)都明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;補(bǔ)腎

12、壯督方的三個(gè)中藥組之間比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　?、莞鹘MmiRNA-125a-5p靶基因TP53INP1及p21、活化的Caspase-3的蛋白表達(dá)變化
　　與假手術(shù)組比較，模型組的TP53INP1、p21和活化的Caspase-3(Active Caspase-3)蛋白表達(dá)都明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;與模型組相比，低、中、高劑量中藥組的TP53INP1、p21和caspase-3的基因表達(dá)都明

13、顯減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);補(bǔ)腎壯督方的三個(gè)中藥組之間比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.腰椎間盤(pán)退變患者外周循環(huán)血漿中存在差異表達(dá)的miRNA，血漿miRNA-4767和miRNA-125a-5p在LIDD患者中的表達(dá)顯著降低。
　　2.血漿miRNA-4767和miRNA-125a-5p對(duì)LIDD的診斷具有較好的診斷效能，有望成為腰椎間盤(pán)退變精準(zhǔn)診斷的新型生物標(biāo)志物。
　　3.

14、補(bǔ)腎壯督方能夠有效的延緩大鼠腰椎間盤(pán)退變的病理改變，降低椎間盤(pán)退變的病理評(píng)分，并且療效具有一定的劑量依賴(lài)性。
　　4.miRNA-125a-5p在腰椎間盤(pán)退變的大鼠血漿及退變的椎間盤(pán)組織中表達(dá)明顯降低，而在其靶基因TP53INP1及p21、Caspase-3的表達(dá)則明顯升高。這表明在LIDD的過(guò)程中miRNA-125a-5p及其靶基因TP53INP1介導(dǎo)的通路被激活，miRNA-125a-5p是腰椎間盤(pán)退變的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。