ABCA1胞外第四環(huán)缺失突變體的構建及其抗砷性研究.pdf

1、目的：構建ABCA1蛋白胞外第四環(huán)第1479～1597位氨基酸殘基缺失的突變體。轉染HeLa細胞后觀察其抗砷性變化，推測此突變體可能發(fā)揮的功能。
　　 方法：采用重疊區(qū)擴增基因拼接法構建ABCA1第1479～1597位氨基酸殘基缺失的突變體基因，并將其克隆至pcDNA3.1/V5-His/ABCA1載體上，脂質(zhì)體法轉染HeLa細胞，激光共聚焦觀察突變體蛋白定位，Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒檢測其48

2、h急性砷中毒后生存率的變化，流式細胞術檢測細胞凋亡率的改變，原子熒光吸收光譜法檢測細胞內(nèi)的總砷含量。
　　 結果：該突變體基因經(jīng)DNA序列分析表明：具有正確的序列和閱讀框。激光共聚焦證實其表達的蛋白仍然能正確定位在HeLa細胞的細胞膜上。CCK-8結果顯示轉染wild-type ABCA1(WT)質(zhì)粒和ABCA1△1479～1597AA(ABCA1△)質(zhì)粒的細胞在各種砷濃度下生存率都較空載體對照組(control)高。隨機區(qū)組設

3、計的方差分析比較各濃度下三組之間生存率的差異，WT、ABCA1△與對照組的P值均小于0.01 ,證明WT、ABCA1△與對照組的生存率差異均有統(tǒng)計學意義（WT與ABCA1△生存率無差異）。WT以及ABCA1△的半數(shù)抑制濃度IC50分別為31.333μmol/L、28.631μmol/L，均高于對照組半數(shù)抑制濃度17.710μmol/L。流式細胞術結果顯示，轉染W(wǎng)T質(zhì)粒和ABCA1△質(zhì)粒的細胞在30μmol/l的砷濃度下細胞凋亡率都較對照

4、組低。原子熒光分光光度法結果顯示，ABCA1蛋白高表達后，WT組和ABCA1△組HeLa細胞內(nèi)砷含量在各時間段均低于對照組細胞，且4h后細胞內(nèi)砷蓄積量趨于穩(wěn)定，而對照組細胞內(nèi)砷蓄積量持續(xù)增加。
　　 結論：成功構建了ABCA1細胞外第四環(huán)第1479～1597位氨基酸殘基缺失的突變體，且其表達的蛋白仍然正確定位于HeLa細胞的細胞膜上，突變體ABCA1△1479～1597仍然具有一定的抗砷性，且與wild-type ABCA1無明