谷氨酰胺對饑餓小鼠小腸乳脂肪球上皮生長因子E8表達(dá)的影響.pdf

1、目的：乳脂肪球上皮生長因子 E8（MFG-E8）是由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞合成分泌的一種可以與磷脂酰絲氨酸及整合素受體結(jié)合的糖蛋白。研究指出MFG-E8在維持腸上皮穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)腸黏膜損傷修復(fù)中可發(fā)揮重要作用，這使得重組MFG-E8作為一種修復(fù)腸道損傷的潛在制劑進(jìn)入人們的視野并引起廣泛的關(guān)注。然而目前對于MFG-E8的研究主要集中在腸道炎癥性損傷方面，對于其在腸道饑餓損傷方面的研究尚未有相關(guān)報道。因此我們首先借助小鼠饑餓損傷模型，檢測饑餓應(yīng)激

2、后小鼠小腸黏膜MFG-E8表達(dá)的變化情況，探討MFG-E8在小腸饑餓應(yīng)激中發(fā)揮的作用。其次，作為人體含量最多的一種氨基酸，谷氨酰胺（Gln）可減輕由饑餓導(dǎo)致的腸道損傷，但其具體機(jī)制仍不明了。我們通過小鼠饑餓狀態(tài)下谷氨酰胺灌胃模型檢測谷氨酰胺對饑餓小腸黏膜MFG-E8表達(dá)的影響，嘗試探索谷氨酰胺是否可以通過影響腸道MFG-E8的表達(dá)而發(fā)揮腸道保護(hù)作用。最后，因小腸MFG-E8由固有層巨噬細(xì)胞表達(dá)，我們在體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，通過用不同濃度谷

3、氨酰胺培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7），檢測其對MFG-E8蛋白表達(dá)的影響，以對體內(nèi)試驗的結(jié)果進(jìn)行初步的機(jī)制探討。
　　方法：第一部分：首先驗證饑餓損傷是否可以改變腸道MFG-E8的表達(dá)。通過預(yù)實驗及相關(guān)實驗報道，我們得知小鼠在禁食24h后，出現(xiàn)明顯的應(yīng)激行為；48h后活動明顯減少；72h后活動已很微弱；84h后小鼠開始死亡。小鼠體重下降在禁食72h后趨于平緩，因此我們選取小鼠體重下降近于最低值而又未死亡的禁食7

4、2h的小鼠作為研究對象。將20只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組。正常對照組(NC組，10只)正常飲食，自由攝水；全饑餓組(S組，10只)無飼料供給，自由攝水。饑餓72h后脫頸法處死小鼠，取小腸組織。HE染色看小腸絨毛發(fā)育情況；TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測小腸組織MFG-E8mRNA及MFG-E8蛋白表達(dá)。第二部分：測谷氨酰胺對饑餓小鼠小腸MFG-E8表達(dá)的影響。將25只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)

5、分為正常對照組(NC組，n=5),全饑餓組(S組，n=5)和谷氨酰胺灌胃組(G組，共15只)。其中谷氨酰胺灌胃組根據(jù)不同的灌胃量（1g/kg/d，3g/kg/d，5g/kg/d）分為3個亞組G1組（n=5）、G3組（n=5）、G5組（n=5）。NC組正常飲食，自由飲水。S組和G組僅自由飲水。G組給予不同劑量谷氨酰胺水溶液灌胃，每天一次，每次0.5ml，共三次。NC組和S組每天給予生理鹽水灌胃0.5ml。72h后脫頸法處死小鼠取小腸組織。

6、同第一部分測小腸絨毛發(fā)育情況，細(xì)胞凋亡，小腸組織MFG-E8mRNA及MFG-E8蛋白表達(dá)。第三部分：體外測不同濃度谷氨酰胺對RAW264.7細(xì)胞的增殖及對MFG-E8表達(dá)的影響。正常嚙齒類動物和人類血清谷氨酰胺的濃度約為0.6mM，正常細(xì)胞培養(yǎng)及長期儲存的谷氨酰胺濃度為2mM，同時研究指出大于等于8mM的谷氨酰胺濃度可誘導(dǎo)多種細(xì)胞和組織大量表達(dá)熱休克蛋白（HSPs），抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)。因此我們選用0、0.6、2、10mM的谷氨酰胺孵育

7、RAW264.7細(xì)胞，測谷氨酰胺對其增殖以及表達(dá)MFG-E8的影響。
　　結(jié)果：第一部分：小鼠饑餓72h后小腸絨毛呈現(xiàn)萎縮性改變：黏膜層薄而稀疏，隱窩深度降低，絨毛面積減少，同時伴隨著上皮細(xì)胞凋亡的增加。MFG-E8在基因水平和蛋白水平表達(dá)均增加。第二部分：谷氨酰胺灌胃后小腸絨毛萎縮狀態(tài)改善，黏膜上皮細(xì)胞凋亡減少，尤以3g/kg/d組最為顯著。MFG-E8mRNA和蛋白均較單純饑餓組降低，且mRNA降低與谷氨酰胺灌胃量呈劑量依賴。

8、第三部分：在體外，谷氨酰胺對 RAW264.7細(xì)胞生長增殖具有重要促進(jìn)作用。隨著谷氨酰胺濃度增高細(xì)胞增殖越快。當(dāng)缺乏谷氨酰胺時，細(xì)胞呈現(xiàn)不增長甚至負(fù)增長。而其表達(dá) MFG-E8蛋白的能力卻隨著濃度增高而降低，即缺乏谷氨酰胺時，MFG-E8蛋白表達(dá)量最高。
　　結(jié)論：1、小鼠饑餓應(yīng)激導(dǎo)致小腸出現(xiàn)損傷性改變：腸絨毛萎縮，腸上皮細(xì)胞凋亡增加。而此時出現(xiàn)MFG-E8蛋白及mRNA水平的升高，提示MFG-E8的升高可能是小腸饑餓損傷后的一種

9、自我保護(hù)性反應(yīng)。2、谷氨酰胺灌胃改善了小鼠饑餓應(yīng)激后出現(xiàn)的小腸絨毛萎縮、上皮細(xì)胞凋亡增加，證實谷氨酰胺對于饑餓應(yīng)激導(dǎo)致的小腸損傷確實有保護(hù)作用。小鼠饑餓應(yīng)激后出現(xiàn)MFG-E8蛋白及mRNA水平增高，而谷氨酰胺灌胃后MFG-E8蛋白及mRNA均較單純饑餓狀態(tài)下降低。進(jìn)一步證明作為一種與腸黏膜損傷修復(fù)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，MFG-E8可作為饑餓后反映小腸代償功能的指標(biāo)。關(guān)注 MFG-E8表達(dá)的變化，可及時了解腸道的功能狀況以采取相應(yīng)的干預(yù)措施。