成人混合表型急性白血病的臨床和分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、【目的】
　　1.系統(tǒng)總結(jié)單中心按 WHO-2008診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的成人混合表型急性白血病（MPAL）患者，分析其臨床、形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)（MIC）特征。
　　2.應(yīng)用靶向外顯子捕獲+重測序技術(shù)及微陣列比較基因組雜交（array-CGH）技術(shù)對部分MPAL患者進(jìn)行了基因突變的篩選及DNA拷貝數(shù)變異（CNVs）的檢測，闡述MPAL的分子遺傳學(xué)特征。
　　3.闡述MEF2C基因在急性髓系白血病中的的臨床意義及生物學(xué)效

2、應(yīng)。
　　【方法】
　　1.從1998年1月至2011年7月期間于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的4780例確診的急性白血病中，按照 WHO-2008標(biāo)準(zhǔn)篩選 MPAL，收集患者初診時白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板以及形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等資料；對于部分在我中心治療的MPAL患者，分析其臨床治療方案及預(yù)后。
　　2.收集 MPAL患者初診時骨髓單個核細(xì)胞，采用多重巢式 RT-PCR方法對42例MPAL患者進(jìn)行白血病常見的29

3、種融合基因的檢測；采用基因組DNA-PCR方法對31例MPAL患者擴(kuò)增C-KIT、NPM1、FLT3-TKD、FLT3-ITD、EZH2、RUNX1、ASXL1、 IDH1、IDH2、CBL、WT1、TET2、DNMT3、PHF6、FBXW7、NOTCH1和ETV6共16種基因，PCR產(chǎn)物用直接測序法分析是否存在基因突變，另外IKZF1基因是否存在變異采用 RT-PCR和毛細(xì)管電泳方法檢測；利用人外顯子捕獲芯片對28例MPAL患者進(jìn)行了

4、與腫瘤發(fā)生相關(guān)的500種基因變異的分析；利用人安捷倫244k的CGH芯片對12例MPAL患者進(jìn)行了基因拷貝數(shù)的檢測，闡述MPAL患者的分子遺傳學(xué)特征。
　　3.采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測我中心83例初診成人AML患者的骨髓液單個核細(xì)胞、12例正常對照骨髓液單個核細(xì)胞中MEF2C基因mRNA表達(dá)水平。比較MEF2C基因mRNA表達(dá)水平在AML患者和正常對照之間以及AML各亞組之間的差異。分析MEF2C基因mRNA表達(dá)水平與AML

5、患者無事件生存(EFS)、總體生存(OS)的關(guān)系。同時制備MEF2C過表達(dá)載體及靶向抑制MEF2C的shRNA慢病毒載體，分別侵染髓系白血病細(xì)胞株Dami，采用絕對計數(shù)等方法檢測其對細(xì)胞增殖能力的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.117例MPAL患者臨床及MIC特征分析
　　從1998年1月至2011年7月期間在我中心確診的4780例急性白血病患者中，根據(jù)2008年WHO標(biāo)準(zhǔn)共篩選出117例（2.4％）患者可以被確診為MP

6、AL（60例男性和57例女性），中位年齡為35歲（14-81歲）。MPAL患者初診時在骨髓原始細(xì)胞比例、血紅蛋白和血小板計數(shù)方面與其它類型急性白血病無明顯差異，但高白細(xì)胞計數(shù)和肝脾腫大相對多見。依照FAB分型標(biāo)準(zhǔn)，40例（34%）的患者表現(xiàn)為AML，M1和M5多見。51例（44%）的患者被歸為ALL-L1，其余26例（22%）患者依據(jù)形態(tài)學(xué)無法分類，被歸為不能分類的急性白血病。
　　117例患者中有64例（55%）為B淋系和髓系混

7、合表達(dá)，38例（33%）為T淋系和髓系的混合表達(dá)，14例（12%）為B淋系和T淋系混合表達(dá)，另一例（0.9%）為T、B和髓三系混合表達(dá)。B和T淋系混合表達(dá)的MPAL多見于男性，14例T和B淋系混合表達(dá)的病例中有11例（79%）為男性，與其他兩組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.01）。82%的病例顯示了白血病細(xì)胞表面存在CD34的高表達(dá)。
　　在92例能成功進(jìn)行核型分析的MPAL病例中，33例（36%）患者未發(fā)現(xiàn)核型異常，而59例（64%

8、）患者顯示了核型異常。其中復(fù)雜核型異常（≥3種異常）最為常見（22/92例；24%）。14例（15%）患者存在t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1融合基因陽性，且均為B+My混合表型。7例患者（7/92;7.6%）存在單體7；7例患者（7/92;7.6%）有21多體。5例患者（5/92;5.4%）患者存在+8異常，且均為B+My混合表型。4例患者（4/92;4.3%）存在t(v;11q23)/MLL重排異常，其中兩例為t(

9、11;19)(q23;p13)、1例為t(4;11)(q21;q23)、1例為t(9;11)(p22;q23)。3（3/92;3.3%）為t(10;11)(p15;q21)，其中兩例為T+My混合表達(dá)，1例為B+T淋系混合表達(dá)。在另外3例患者中發(fā)現(xiàn)了三種迄今為止尚未報道過的染色體易位，1例B+My患者為t(7;9)(q32;p24)，1例B+T患者為t(2;9)(q13;q34)，另1例T+My患者為der(9)t(9;11)(p21;

10、q12)。在1例核型分析為t(3;11)(q29q13;p15)del(3)(q29)的患者中發(fā)現(xiàn)了最近報道過一種新的融合基因，即NUP98和IQCG基因的融合。
　　34例初治MPAL的患者在我中心接受了治療。24例患者接受了兼顧淋系和髓系的聯(lián)合方案，14例（58%）取得了完全緩解（CR），另外10例接受CAG方案誘導(dǎo)治療的患者中7例（70%）取得了緩解。在CR率上兩組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.802)。其中6例采用聯(lián)合方案誘導(dǎo)

11、失敗的患者中采用CAG方案再誘導(dǎo)化療，有5例(83%)患者再次獲得了CR。而且8例接受異基因造血干細(xì)胞移植的患者總生存優(yōu)于單純化療組的MPAL患者（中位生存時間分別為22個月和9個月；P=0.004）。
　　2. MPAL患者的分子遺傳學(xué)特征研究
　　多重巢式RT-PCR結(jié)果：12例（28.6%）患者檢測到存在BCR/ABL融合基因（其中7例患者在染色體核型檢查時也發(fā)現(xiàn)了Ph染色體）。3例染色體核型正常的MPAL患者中，我們

12、分別檢測到SIL/TAL1融合基因（1p32微缺失所致）, dupMLL基因重排和MLL/AF9融合基因各1例。另外我們還在1例伴有t(16;17)等復(fù)雜核型異常的MPAL患者中檢測出SET/CAN融合基因。
　　基因突變分布及發(fā)生率：31例MPAL患者采用PCR、Sanger、毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行了17個基因的突變檢測，其中12例患者（39%）檢出≥1種基因突變，包括IKZF1缺失4例（4/31；13%）、EZH2突變3例（3/

13、31；9.7%）、ASXL1突變2例（2/31；6.5%）；ETV6、NOTCH1和TET2突變各1例（1/31；3.2%）。31例患者中，11例成功進(jìn)行了核型分析，發(fā)現(xiàn)10例患者存在核型異常。8例伴t(9;22)(q34;q11)和B+My異常的MPAL患者有4例（50%）檢測到IKZF1缺失。對其中24例患者的預(yù)后進(jìn)行了分析，突變陽性和陰性組的患者之間未發(fā)現(xiàn)明顯的生存差異（P=0.158）。
　　外顯子捕獲測序分析：28例MP

14、AL患者進(jìn)行了人外顯子捕獲和測序，結(jié)果與人參考的基因組（Hg19）相比較，剔除SNPs。顯示42.9%（12/28）具有表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因的突變，最常見的突變?yōu)镋ZH2基因突變（4/28；14.3%），3例T淋系和髓系混合表達(dá)的MPAL中發(fā)現(xiàn)了DNMT3A基因突變（3/28；10.7%），GATA2和TET2基因突變各2例（7.1%），1例MPAL患者中發(fā)現(xiàn)存在IDH1基因突變。上述突變的患者部分還伴有其它基因異常，如NOTCH1和TP

15、53基因。未發(fā)現(xiàn)其它表觀遺傳學(xué)相關(guān)調(diào)控基因存在突變，如KRAS、NRAS、CREBBP和NF1等。在此組病例中，還同時發(fā)現(xiàn)另外9例MPAL患者中存在IKZF1（4/28；14.3%）、ASXL1（2/28；7.1%）、RUNX1（2/28；7.1%）和ETV6（1/28；3.6%）四種重要轉(zhuǎn)錄因子的基因變異（共占32.1%）。本研究中共發(fā)現(xiàn)75%的成人MPAL患者在初診時存在體細(xì)胞水平的基因變異。
　　array-CGH分析結(jié)果：

16、12例MPAL患者進(jìn)行了array-CGH分析，發(fā)現(xiàn)每例患者至少有一種基因組異常，共發(fā)現(xiàn)68種基因組異常，平均每例樣本有5.7種異常。在此組MPAL病例中，我們新發(fā)現(xiàn)了幾種隱匿性的拷貝數(shù)異常，如CDKN2A(4/12)、IKZF1(3/12)、MEF2C(2/12)，同時還發(fā)現(xiàn)BCOR、EBF1、KRAS、LEF1、MBNL1、PBX3和RUNX1異常各1例（8.3%）。
　　3. MEF2C在成人AML患者中的表達(dá)、意義及其功能

17、的初步探討
　　（1）AML患者M(jìn)EF2C基因mRNA表達(dá)水平高于正常對照組（P值=0.0377）。按FAB分型分組：FAB-M5亞組AML患者M(jìn)EF2C基因mRNA表達(dá)水平明顯高于FAB-M1、M2、M4亞組（P值分別為0.029、0.003、0.021）；FAB-M3亞型組AML患者 MEF2C基因 mRNA表達(dá)水平明顯低于其它組（P值均＜0.001）；而FAB-M1/M2、M1/M4、M2/M4組間AML患者的MEF2C基因

18、mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.2、0.055、0.279）。
　　按染色體核型進(jìn)行分組，其它核型AML患者組MEF2C基因mRNA表達(dá)水平高于CBF-AML和正常核型組（P值分別為0.036和0.033）；伴有t(15;17)異常的AML患者組MEF2C基因mRNA表達(dá)水平明顯低于其它核型組（P=0.003）。
　?。?）采用Kaplan-Meier分析，正常核型AML患者中MEF2C基因mRNA低表達(dá)組和高表

19、達(dá)組患者3年EFS分別為56％和20％，MEF2C基因mRNA低表達(dá)組的EFS優(yōu)于高表達(dá)組（P=0.048）；低表達(dá)組和高表達(dá)組患者的3年OS分別為40％和16％（P=0.07）。而MEF2C基因mRNA表達(dá)與CBF-AML及其它中危核型患者的預(yù)后沒有關(guān)系，EFS和OS差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均>0.05）。
　　（3）使用兩條獨立的shRNA序列能有效抑制髓系細(xì)胞株Dami細(xì)胞中的MEF2C表達(dá),沉默MEF2C使髓系細(xì)胞株Dam

20、i細(xì)胞的生長及集落形成能力下降。但在Dami細(xì)胞株中過表達(dá)MEF2C未見到對其增殖能力造成明顯影響。
　　【結(jié)論】
　　1.成人MPAL是一組異質(zhì)性較大的疾病，在急性白血病中發(fā)生率為2.4%。MPAL以B淋系和髓系混合表達(dá)最為常見，64.1%的患者存在細(xì)胞遺傳學(xué)異常，其中以復(fù)雜核型和Ph染色體異常相對常見?，F(xiàn)有化療方案預(yù)后差，異基因造血干細(xì)胞移植有可能改善其長期生存。
　　2.多重巢式PCR技術(shù)可以提高M(jìn)PAL患者基因

21、重排的檢出率。MPAL患者中存在高頻率的基因變異率，75%的成人MPAL患者在初診時可以被檢出存在基因變異，包括表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因（42.9%）和重要轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)基因（32.1%）。
　　3.在2例MPAL患者中首次發(fā)現(xiàn)存在再現(xiàn)性的轉(zhuǎn)錄因子MEF2C的新激活方式-基因缺失。AML患者中MEF2C基因mRNA表達(dá)水平明顯升高，對于正常核型AML患者而言，熒光實時定量檢測MEF2C基因mRNA表達(dá)水平有提示預(yù)后的價值；沉默MEF2C